روش صافي غشايي آزمايشات ميكروبي آب :

روش صافي غشايي آزمايشات ميكروبي آب ،روشها و فنون مورد نياز براي آزمـايش تعيـين مجمـوع كليفـرمهـا و كليفـرمهـاي مـدفوعي اساسـا مشـابه اسـت. استثنائاتي در انتخاب محيط كشت، انكوباتور، دماي انكوباسيون، ميزان ماكزيمم كلنيهاي رشد يافته بر روي صافي، زمان مجاز قبل از قرائت كلونيها و اختلاف در رنگ كلنيهاي آزمايش وجود دارد. جزئيات بيشتري در مورد كليفيرمهاي مدفوعي در طي اين متن ارائه ميشود.

لوازم مورد نياز روش صافي غشايي آزمايشات ميكروبي آب :

موقعي كه وسايل و مواد مورد نياز براي روش صافي غشايي انتخاب ميشود آزمايش كننده گزينه هاي مختلفي را در پيش رو دارد. از آنجاييكه اغلب آزمايشگاهها مخصوصا آزمايشگاههاي كوچكتر با محدوديتهاي بودجه روبـه رو هسـتند بايد مقداري هماهنگي وجود داشته باشد. لذا فهرست زير، گزينه هاي مختلفي را ارائه مينمايد، كه ميتوان مناسبتـرين آنها را بر حسب نيازهاي خاص انتخاب نمود.
جائي كه تسهيلات مناسب يا پرسنل كافي نداشته باشد وسايل يا مواد مصرفي ليست شده ميتواند راه حـل ممكـن باشد. با وجود اين بايستي تيمهاي انتخابي مثل محيط كشت آماده و ظروف كشـت جهـت تضـمين كيفيـت مطلـوب و رضايت بخش بر طبق توصيه “روشهاي استاندارد” از طريق سازنده آنها تائيد شود.

وسايل غير مصرفي :

• انكوباتورها (با كنترل دماي 35و 44/5درجه سلسيوس.)
  براي مجموع كليفرمها از اتاقك هوا، دماي يكسان و ثابت 35 درجه سلسيوس استفاده نماييد، براي كليفـرم مدفوعي از بن ماري يا محفظه آلومينيومي استفاده كنيد كه دما را در 44.5 درجه سلسيوس كنترل ميكند.
• استريل كنندهها، از موارد زير انتخاب كنيد:
  اتوكلاو (يا ديگر استريل كندههاي با بخار تحت فشار)، استريل كننده كورهاي يا استريل كننده ماورا بنفش UV
• ترازو با دقت 0.1گرم،
• pH متر،
• پمپ خلا، 115ولت، 60هرتز،
• بشرهاي آزمايشگاهي 50و 100ميليليتري، 1يا 2ليتري،
• مزور 100ميليليتري،
• ارلن ماير 250ميليليتري با در بطري پيچي،
• صفحه گرم كننده الكتريكي (هات پليت) و بهم زدن مغناطيسي با كنترلهاي متغير،
• بطريهاي نمونه، 120ميليليتر (4اونس)، شيشه بروسيليكات يا پلي پروپيلن قابل اتوكلاو،
• پي پتهاي 10ميليليتري و 1ميليليتري، شيشهاي مقاوم به گرما، مدرج شده(موهر يا سرولوژيكي)،
• بطريهاي رقيق سازي، با خط نشانه 99ميليليتر،
• گيرهها، فولاد ضد زنگ، با نوك غير دندانهاي،
• ارلنهاي خلا، 1ليتري،
• لوله خلا، چسب لاستيكي يا سيليكون لاستيكي، 1.5متر طول، 5ميليليتر اينچ قطر داخلي،
• نگهدارنده صافي غشايي، 47ميليليتر (شيشهاي، پلاستيكي قابل اتوكلاو، اسـتريل يكبـار مصـرف، يـا اسـتيل ضـد زنگ)،
• چراغ بونزن يا چراغ الكلي،
• ميكروسكوپ با عدسي درشت نما با بزرگنمايي 10برابر و 20برابر همراه با چراغ فلورسنت

وسايل و مواد مصرفي :

1. روش صافي غشايي آزمايشات ميكروبي آب ، از قبل استزيل شده، مشبك با قطر 47ميليمتر، بسته بندي شده همراه با صفحات جاذب يا بدون آن و مطابق با آخرين “روشهاي استاندارد“
2. پتري ديش پلاستيكي از قبل استريل شده، 47ميليمتر (همراه با صفحه يا بدون آن)،
3. آبگوشت ،M – Endoشيشه 100گرمي پوند براي مجموع كليفرمها،
4. آبگوشت ،M – Fcآمپولهاي 2ميليليتري،
5. اسيد روزاليك، بطري 25گرمي،
6. فسفات دي هيدروژن پتاسيم ، درجه معرف Reagent Grade
7. تيوسولفات سديم، درجه معرف
8. دانه هاي بلور هيدروكسيد سديم، درجه معرف
9. متانول تكنيكال و اتانول ذرات خالص %95طبيعي Non – denatured
10. پي پتهاي استريل، قابل دسترس،(Prefabricated)كه با 1ميليليتر و 10ميليليتر مدرج شده اند،
11. وسايل صافي استريل، از قبل اماده شده، به اندازه روزنه 0.22ميكرومتر يا 0.45ميكرومتر (يك گزينـه بـراي صـاف
    كردن استريل محلول تامپون).
    توجه: آب خالص آزمايشگاهي بايد براي آماده سازي آب رقيق سازي تامپون فسفات و آب شستشو به كار بـرود. آب مقطر (به دست آمده از دستگاه تقطير كه به طريق توليد بخار انجام ميشود) يا آب صاف شده به روش يون زدايي De  ionized waterاز واحدي كه داراي ستون كربن است براي استفاده مناسب اسـت. بـراي كيفيـت توصـيه شـده جهت آب خالص آزمايشگاهي به جداول منتشره در “روشهاي استاندارد” رجوع كنيد. آناليز كننده بايد آگاه باشـد كـه دستگاه تقطير و برخي از انواع سيستمهاي يون زداينده آب ميتوانند كلر، كلرآمينها و آمينهاي سمي ديـگ بخـار را از خود عبور دهند. اين عوامل و يا فلزات سنگين ميتوانند براي ارگانيسمهاي آزمايش سمي باشند و جواب منفي ناصحيح در بر داشته باشند. روش صافي غشايي آزمايشات ميكروبي آب                                                                                              آماده سازي محلول هاي مربوط به محيط كشت و تامپون و خنثي سازي:
    براي آزمايشگاههايي كه كمتر از 150آزمايش در روز انجـام مـيدهنـد، آمپـولهـاي تضـميني 2ميلـيليتـري (يـا آمپولهاي 50ميليليتري) از آبگوشت M – Endoتهيه شود، يا آبگوشت M – Fcكه ارزانتر هستند و بـراي اسـتفاده مناسبترند. جايي كه آماده سازي محيط كشت و مواد مورد نياز است موارد زير مفيد خواهد بود. روش صافي غشايي آزمايشات ميكروبي آب

آبگوشت(M – Endoمجموع كليفرمها) :

روش صافي غشايي آزمايشات ميكروبي آب :

• مقدار 4.8گرم از محيط كشت M – Endoبدون آب را داخل ظرف (ديش) توزين شده بريزيد و وزن كنيد.
• دو ميليليتر از اتيلن الكل 95درصد طبيعي را به 100ميليليتر آب خالص آزمايشگاهي در يك مزور اضافه كنيد.
• به طور تقريبي 20ميليليتر از محلول را از مزور به ارلن ماير 250ميليليتري با در بطري پيچشي سرازير كنيد.
• مقادير مربوط به پتري ديش توزين شده را به داخل ارلن ماير اضافه كنيد و بهم بزيند تا محيط مجدداً آبدار شود.
• مقادير باقيمانده مزور را به ارلن ماير اضافه كنيد و كاملا آنرا مخلوط نماييد.
• ارلن ماير را همراه با پوشش نرم در بن ماري يا در يك بشر موقت و حمام آب صفحه داغ الكتريكي قرار دهيد.
• محيط كشت را براي 3تا 5دقيقه حرارت داده، به نقطه جوش برسانيد اما اجازه ندهيد بجوشد.
• سپس آنرا خارج كرده و تا 45درجه سلسيوس سرد كنيد. pHمحيط را كنترل كنيد اگر لازم است pHرا بين 7.1 و pHمساوي 7.3با NaOHيا HCLيك نرمال تنظيم كنيد. pHمحيط خشك احيا شده به نـدرت بـه تنظـيم نيـاز دارد.
• مقدار 1.8تا 2ميليليتر از محيط كشت را به داخل ظروف پتري 47ميليمتري محتوي صفحه جاذب پخش كنيد.
• محيط كشت باقيمانده ممكن است در 2تا 10درجه سلسيوس براي حداكثر 96ساعت سرد شود. (بعد از تهيـه در يك ظرف درپوش دار ذخيزه ميشود). با وجود اين بهتر است به طور روزانه محيط تازه تهيه شود. براي نتـايج مناسـب بايد اين محيط كشت را در برابر محيط كشتهاي معروف آزمايش كرد. روش صافي غشايي آزمايشات ميكروبي آب

آبگوشت  M – Fc كليفرم مدفوعي:

• صد ميليليتر از آب خالص آزمايشگاهي را 3.7گرم از محيط خشك M – Fcدر يك ارلن ماير 250ميليليتـري بـا در بطري پيچشي بيافزاييد.
• در يك ارلن ديگر، 100ميليليتر از محلول هيدروكسيد سديم 0.2نرمال 0.8گرم از NaOHدر 100ميليليتـر را به 1گرم از اسيد روزاليك براي توليد محصول %1اسيد روزاليك اضافه نماييـد ميـزان محلـول پايـه اسـيد روزاليـك  ممكن است در 2تا 10درجه سلسيوس در محيط تاريك ذخيره شود و بعد از 2هفته دور انداخته شود و يا اگر رنگ آن از قرمز تيره به قهوهاي خاكي تغيير نمايد فورا دور ريخته ميشود.
• يك ميليليتر از محلول %1اسيد روزاليك را به آبگوشت خشك M – Fcانتقال دهيد.
• محيط را در يك ارلن با پوشش نرم تا نقطه جوش حرارت دهيد، سپس فـورا آن را خـارج سـازيد و زيـر 45درجـه سلسيوس آن را سرد كنيد. اتوكلاو نكنيد pHنهايي بايد 7.4باشد.
• همانند آبگوشتM – Endoدر دماي اتاق آن را تقسيم نماييد. بخـش اسـتفاده نشـده آن را در دمـاي 2تـا10 درجه سلسيوس نگه داريد و بعد از 96ساعت دور بريزيد.

تامپون فسفات در روش صافي غشايي آزمايشات ميكروبي آب :

تامپون فسفات براي رقيق سازي و شستن نمونهها بكار مـيرود. ايـن محلـول بايـد اسـتريل شـود چـون هريـك از ارگانيسمهاي حاضر درتامپون ممكن است با رشد زياد در غشا، توليد مواد سمي يا رقابت بر سر مواد غذايي در شـمارش كليفرمها مزاحمت ايجاد مينمايد.

روش صافي غشايي آزمايشات ميكروبي آب