رنگ آميزي باکتری:

برای رنگ آميزي باکتری باید محلولی که ترکیب آن به شرح زیر آمده است را به وسيله كاغذ صافي ،صاف كرده و در يك شيشه يا بطري درب دار رنگ آميزي بريزيد. محلول لوگل ، اصلاح شده براي رنگ آميزي گرم  را در يك هاون پودر كنيد. آب مقطر را كم كم اضافه كرده KI 1 گرم كريستال يد و 2 گرم( هر بار چند ميلي ليتر بيفزائيد و مخلوط را كاملا بسائيد تا حل شود. محلول حاصل را با آب باقي ماندهشسته و در يك بطري شيشه اي كهربايي بريزيد. كلاً 300 ميلي ليتر آب استفاده كنيد…

% 2 گرم كريستال ويوله (حاوي 90 : ( ucker ‘ S ) ا ) اكسالات آمونيوم كريستال ويوله ( NH4 ، H2O 0 گرم از اكسالات آمونيوم / ماده رنگي) را در 20 ميلي ليتر الكل اتيليك 95 % حل كنيد 82( را در 80 ميلي لتر آب مقطر حل كنيد . دو محلول را مخلوط و قبل از اينكه آن را مصرف كنيد C2 O4
24 ساعت بگذاريد تا بماند .

محلول مخالف رنگ:
2/5 گرم از رنگ سافرانين خشك را در 100 ميلي ليتر الكل اتيليك 95 % حل كنيد . 10 ميلي ليتر از آن را به 100 ميلي ليتر آب مقطر اضافه نمائيد. محلول را در بطري هاي در دار نگهداري كنيد…

الكل استون:

حجم هاي مساوي از الكل اتيليك 95 % و استون را با هم مخلوط كنيد.

روش انجام آزمايش:
با حفظ شرايط سترون از هر يك لوله ه اي آبگوشت لاكتوز برليان گرين ب يل برات كه در آن گاز مشاهده شده ، بلافاصله پس از مشاهده گاز به كمك لوپ يك كشت خطي بر روي محيط كشت يا آگار مك كانكي انجام دهيد . پليت ها را به گونه اي كشت خطي دهيد كه كلني LES Endo آگار
0 از يكديگر روي محيط كشت رشد كنند.در صورت حضور باكتري / 5cm هاي منفرد به فاصله حداقل هاي گروه كليفرم ، براي تشكيل كلني هاي مجزا ، به هنگام گسترش خطي نمونه روي آگار به نكات زير توجه كنيد: از يك لوپ استريل با قطر 3 ميليمتر يا يك ميله سوزني شكل كه نوك آن كمي خميده باشد استفاده كنيد.براي اجتناب از چسبيدن لايه سطحي و يا كف روي محيط كشت به نوك سوزن يا لوپلوله را كمي تكان داده،كج كنيد و سپس سوزن را در آن فرو بريد.0 سانتيمتري فرو برده و نمونه / ب 1 3 ) انتهاي سوزن يا لوپ را در داخل مايع تا عمق تقريبا 5
برداريد. نمونه برداشت شده را به وسيله قسمت خميده سوزن يا لوپ روي محيط كشت بماليد تا سطح آن خراشيده و پاره نشود ، در فاصله بين كشت مرحله دوم ( ربع دوم پليت ) و مرحله سوم ( ربع سومپليت ) سوزن يا لوپ را حرارت دهيد تا ضد عفوني شده و در نتيجه كيفيت تفكيك كلني ها بهترصورت گيرد.
پليت ها را به طور وارونه در انكوباتور با دماي0C24 ساعت گرما گذاري كنيد. ± 35±0/5 به مدت 2پس از 24 ساعت گرماگذاري LES Endo ب 2 ) كلني ها گسترش يافته بر روي محيط كشت آگار به يكي از سه شكل تيپيك ( كلني هاي صورتي تا قرمز تيره با جلاي سبز فلزي ) غير تيپيك (صورتي قرمز سفيد يا بي رنگ بدون درخشش ) يا كلني هاي غير كليفرم منفي (ديگر كلني ها ) مشخص مي شوند. كلني هاي تيپيك تخمير كننده لاكتوز كه بر روي محيط كشت آگار مك كانكي گسترش يافته اند، قرمز هستند و ممكن است به وسيله هاله تيره كه بر اثر رسوب صفراي كشت حاصل شده احاطه شده باشند. از هر پليت يك يا چند كلني تيپيك كليفرم كه كاملا ايزوله ( مجزا ) شده باشند برداريد. اگرهيچ كلني تيپيك موجود نباشد از دو يا چند كلني كه بيشترين شباهت را با ارگانيسم هاي گروه كليفرمدارند برداشت كنيد . از هر كلني كاملا مجزا به هر دو لوله تخمير حاوي آبگوشت لاو ريل تريپتوز و آگار مغذي شيبدار انتقال دهيد (براي نمونه هاي آب آشاميدني استفاده از محيط كشت دوم ضرورتي ندارد).

در صورت نياز به مشاهده و شناسايي دقيق كلني ها به هنگام برداشت آنها از محيط كشت آگاريا آگار مك كانكي از ذره بين استفاده كنيد. هنگام انتقال هركلني يك كلني كاملاً مجزا را Les Endoانتخاب كرده و سپس نوك سوزن سترون شده با شعل ه و خنك شده در هوا را فقط با سطح كلني تماسداده و از آن برداشت كنيد و به اين ترتيب احتمال انتقال يك كشت مخلوط ( آلوده شدن كشت به هنگام انتقال ) را به حداقل برسانيد.

لوله هاي حاوي كشت ثانوي آبگوشت ل وريل تريپتوز كه لوله هاي دور هام در آن قرار گرفته اند
24 ساعت در دماي ± را به مدت 2 35± گرماگذاري كنيد . اگر گاز توليد نشده ، مجددا به 0 / 5 48 ساعت بررسي كنيد . در ± 24 ساعت ديگر گرما گذاري نمائيد . وجود گاز را پس از 3 ± مدت 2 صورت تشكيل گاز در لوله هاي كشت ثانويه بر لوله هاي كشت در اگار خوابيده مربوط به هر لوله مثبت را مشخص كرده و با روش رنگ آميزي گرم و بررسي ميكروسكوپي آزمايش كنيد.

روش رنگ آميزي گرم : براي آب آشاميدني مي توان رنگ آميزي گرم را از مرحله تكميلي حذف نمود زيرا احتمال وجود باكتري هاي گرم مثبت و ميكرو ارگانيسم هاي اسپوردار در اين مرحله ازآزمايش بسيار ناچيز است

شيوه هاي اصلاح شده مختلفي براي روش رنگ آميزي گرم وجود دارد . از روش اصلاح شده براي رنگ آميزي يك گسترش از كشت خالص شامل يك كشت گرم مثبت و يك Hucker توسط كشت گرم منفي به عنوان كنترل،استفاده كنيد. امولسيون هاي رقيق جداگانه اي از نمونه رشد يافته و نيز كشت هاي كنترل مثبت و منفي را يك لام كه قبلا يك قطره آب مقطر روي آن گذاشته ايد تهيه نمائيد . لام را در هوا خشك كرده و با عبوردادن لام از روي شعله باكتري ها را روي آن تثبيت كنيد . پس از اين مرحله لام را به مدت 1 دقيقه بامحلول اكسالات آ مونيوم كريستال ويوله رنگ آميزي نمائيد . لام را زير آب شير شسته و با تكان دادن ، آب اضافي را بگيريد .سپس محلول لوگل را براي مدت 1 دقيقه روي آن بريزيد .
لام رنگ شده را با آب شير بشوئيد . براي رنگ زدائي لام را با انگشتان گرفته و به مدت 15 تا 30 ثانيه محلول ا ستون الكل را روي آن بريزيد تا زماني كه حلال جاري كاملا بيرنگ شود . بيشتر از مدت فوق عمل رنگ زدايي را ادامه ندهيد . با سافرانين به مدت 15 ثانيه مجددا رنگ آميزي نمائيد . لام را با جريان ملايم آب شير بشوئيد . لكه ها را با كاغذ خشك كن يا جريان هواي آزاد خشك كرده و زير ميكروسكوپ آن را بررسي نمائيد . باكتري هاي گرم مثبت به رنگ آبي و باكتري هاي گرم منفي قرمز رنگ ديده مي شوند. نتايج آزمايش زماني قابل قبولند كه كنترل ها نيز واكنش هاي صحيح را داده باشد.

تفسير نتايج
48 ± تشكيل گاز در دومين سري لوله هاي حاوي محيط كشت آبگوشت لوريل تريپتوز در مدت 3ساعت و مشاهده باسيل هاي گرم منفي كه بدون اسپور رشد كرده نشانگر مثبت بودن مرحله تكميلي حضور باكتري هاي گروه كليفرم است . اگر در لوله هاي سري دوم حاوي آبگوشت لوريل تريپتوز در
براي اين نمو نه ها را از روي نتايج آزمايش MPN 48 ساعت گازي تشكيل نشد ، مقدار ± مدت 3 مرحله تأييدي پيشين كه در مورد همين نمونه ها انجام شده محاسبه و بيان كنيد.