روش کار با دستگاه اسپکتروفتومتر

لازمه روش کار با دستگاه اسپکتروفتومتر ابتدا جداکردن عوامل مزاحم از محلول می باشد. براي تعیین مقدار یک ماده باید سعی کنیم حتی المقدور مواد مزاحم را از محیط آزمایش دور کنیم. تا از پیدایش رنگهاي بیگانه و مزاحم جلوگیري گردد. براي این منظور در اغلب اندازه گیري ها به کمک ترکیبات مختلف، پروتئین هاي خون یا پلاسما را رسوب داده و واکنش را بر روي محلول صاف شده انجام می دهند. یا اینکه بعضاً به کمک حلالهاي مناسب، ماده مورد اندازه گیري را از سرم جدا می کنند.

طول موجهاي مختلف، تولید رنگهاي مختلفی را می نمایند و در اسپکتروفتومتري انتخاب طول موج براساس رنگ محلول رنگی صورت می گیرد. یعنی باید طول موجی را انتخاب نمود که رنگ آن مکمل رنگ محلول باشد. به عنوان مثال اگر یک محلول رنگی داشته باشیم و نوري از آن عبور دهیم مقداري از این نور جذب می شود که این نور جذب شده داراي رنگ مکمل رنگ محلول می باشد. که این مقدار بستگی به غلظت محلول رنگی دارد. لذا روش کار با دستگاه اسپکتروفتومتر بوسیله فیلتر و یا منشور و … نور تکرنگ ایجاد می نمایند. تا بتوان غلظت یک محلول رنگی (خاصی) را محاسبه کرد. محلولهاي رنگی در رنگ مکمل خود حداکثر جذب نور را دارند و بر حسب همین خاصیت مربوط به خود مورد مطالعه قرار می دهند. و شدت و ضعف این رنگ بستگی به مقدار ماده موجود در محلول مواد را در طول موجهاي دارد.

محلولهاي مورد استفاده در روش کار با دستگاه اسپکتروفتومتر

محلولهاي استاندارد (standard)

در جذب ابتدا باید واکنش رنگی را با محلولهاي داراي غلظت معین (محلول st) داده و منحنی تغییرات دانسیته اپتیک را نسبت به غلظت هاي مختلف رسم نمود. در صورتیکه منحنی تغییرات خطی باشد (یعنی جذبنوري محلول رنگی از قوانین جذب نوري تبعیت نماید) می توان هنگام اندازه گیري یک ماده در مایع بیولوژیک با روش رنگ سنجی فقط از یک دو محلول استاندارد (استاندارد رقیق و غلیظ) استفاده نموده و مقدار ماده را در مایع بیولوژیک با استفاده از رابطه زیر محاسبه نمود:

محلولهاي شاهد (Blank)

محلولی است محتوي تمام مواد بکار برده شده در آزمایش، به جز ماده مورد اندازه گیري. در تعیین مقدار یک ماده در مایعات بیولوژیک، با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر باید ابتدا با محلول شاهد، عقربه گالوانومتر را روي عدد صفر تنظیم کرد.

اجزا دستگاه اسپکتروفتومتر :

دستگاه اسپکتروفتومتر شامل بخشهاي زیر می باشد: منبع نور ، موازي ساز(عدسی) ، تک فام ساز (منوکروماتور) ، گزینشگر طول موج ، جایگاه کووت یا سل، سل یا دتکتور و مانیتور  (photocell) فتوالکتر.

خصوصیات منبع انرژي:

•  منبع انرژي باید پرتو تولید شده اش داراي انرژي کافی باشد تا در مراحل بعد بتواند دتکت شود (مورد سنجش قرار گیرد).
•  تولید طیف پیوسته نماید (یعنی حاوي تمام طول موجها باشد).
•  پایدار باشد (یعنی قدرت امواج در طول کار تغییر نکند).

انواع منبع انرژي :

• لامپ تنگستن
• لامپ هیدروژن یا دوتریوم
• لامپ جیوه اي

منوکروماتور (تک فام ساز) :

تجزیه کننده اشعه نوري می باشد و باعث ایجاد نور تک رنگ می گردد . داراي انواع زیاد می باشد که فیلترها، منشورها، گراتین گ ها از آن جمله اند. فیلترها م منشورها اکنون کابرد چندانی ندارند. گراتینگ ها یک سري صفحات شیشه اي شفاف اند و یا غیر (grating) شیشه اي ممکن است باشند. بوسیله دستگاههاي تراش حدود 15000 تا 30000 شیار در هر اینچ بر روي آنها قرار می دهند (حدود 10000 در هر cm ) وقتی نور به آنها برخورد می نماید هر کدام از آنها مانند یک منشور عمل می کند و نور را تجزیه می کند.

سلول نمونه یا کووت :

خصوصیاتی که در روش کار با دستگاه اسپکتروفتومتر باید توجه داشت این است که یک کووت باید داشته باشد به شرح زیر است:

•  باید نور تابشی را جذب نکند.
• باید جنس آن از کوارتز یا سیلیکا باشد (براي امواج مرئی از کووت شیشه اي می توان استفاده کرد). (UV)  براي ناحیه ماوراءبنفش  است.قطر آن بستگی به دستگاه دارد ولی معمولاً 1 سانتی متر. شکل آن عموماً استوانه اي یا مکعبی می باشد.

خصوصیات دتکتور:

•  حساس به دامنه وسیعی از طول موجها باشد.
•  حساسیت نسبت به تابشهاي کم انرژي.
•  عکس العمل آنی نسبت به تشعشع هاي مختلف داشته باشد (سریع عمل کنند).
•  عکس العمل الکتریکی که در دتکتور ظاهر می شود مستقیماً متناسب با انرژي تابش شده باشد.

انواع اسپکتروفتومتر :

• اسپکتروفتومتر تک کووتی
• اسپکتروفتومتر دوکووتی