شمارش سودوموناس آئروژینوزا

شمارش سودوموناس آئروژینوزا:

سودوموناس آئروژینوز ا گونه .ای از جنس سودوموناس است که گستردگی زیادی در محیط .های طبیعی دارد و آن .را می توان از آب، خاک و سبزی های خام جدا کرد . سودوموناس آئروژینوزا یک باکتری بیماری.زا و فرصت.طلب است که در افراد بیمار، به ویژه افرادی که سیستم ایمنی تضعیف
شده دارند، ایجاد عفونت می .کند و سبب تأخیر در بهبود زخم ها می شود . این باکتری ممکن است از طریق آب استخرهای شنا که به طور کامل گندزدایی نشده .اند، به شناگران سرایت کرده و سبب ایجاد بیماری.های پوستی و عفونت گوش خارجی در آن ها شود. سودوموناس آئروژینوزا گرم منفی، متحرک، میله .ای، بدون اسپور و ناتوان در تخمیر قندها است . دمای بهینه برای رشد آن 37 درجۀ سلسیوس است .با این وجود در دمای 42 درجۀ سلسیوس هم می تواند رشد کند ولی در دمای کمتر از 4 درجۀ سلسیوس قادر به رشد نیست . این باکتری اکسیدار مثبت بوده و با تجزیه استامید تولید گاز آمونیاک می.کند. بیش از 90 درصد سویه.های  آن، رنگدانه پیوسیانین  به رنگ سبز-آبی تولید می.کنند.

هدف از تدوین این استاندارد تعیین روش جستجو و شمارش سودوموناس آئر وژینوزا به روش صاف کردن غشایی است.

این استاندارد برای انواع مختلف آب شامل آب معدنی و آب استخر های شنا کاربرد دارد. یادآوری – این استاندارد برای آب.هایی که حاوی مقدار قابل توجهی ذرات و مواد معلق هستند به دلیل ایجاد اختلال در فرآیند صاف کردن، کاربرد ندارد.

سودوموناس آئروژینوزا:

میکروارگانیسمی است که روی محیط کشت انتخابی حاوی ستریماید رشد کرده و غالباً با تولید پیوسیانین، ایجاد فلورسنس زیر پرتوی فرابنفش می .کند. این میکروارگانیسم همچنین اکسیداز مثبت بوده و قادر به تولید گاز آمونیاک از استامید است.

روش فوق بر اساس صاف .کردن حجم معینی از نمونه، کشت دادن، گرمخانه گذاری، شمارش و انجام آزمون های تأییدی مطابق با بند 9 این استاندارد است.

مواد لازم:

برای به دست آوردن نتایج هماهنگ، از موادشیمیایی با کیفیت یکسان و درجۀ خلوص آزمایشگاهی استفاده کنید . آب مورد استفاد ه برای تهیه محیط های کشت باید با استاندارد ملی ایران 2747 : سال 1380 مطابقت داشته باشد. چنانچه محیط های کشت در بازار قابل دسترس هستند، تهیۀ محیط های کشت را مطابق با دستورالعمل سازنده انجام دهید.

محیط های کشتسودوموناس آئروژینوزا:

روش تهیه :

مواد فوق را با جوشاندن در آب مقطر حل و سپس در اتوکلاو با دمای 121 درجۀ سلسیوس به مدت 15 دقیقه سترون کنید.

مکمل محیط کشت سی _ ان(CN)

هگز ا دسیل تری متیل آمونیوم بروماید (ستریماید)              0.20گرم

نالیدیکسات سدیم                                                   0.015گرم

آب مقطر سترون                                                      2میلی لیتر

روش تهیه:

مواد فوق را با رعایت شرایط اسپتیک در آب مقطر سترون حل کنید.

یادآوری – مکمل محیط کشت سی _ ان نیاز به اتوکلاوکردن ندارد.

محیط کشت کامل:

:محیط کشت پایه را تا دمای 45 تا 50 درجۀ سلسیوس سرد کنید. سپس با رعایت شرایط اسپتیک به ازای هر 500 میلی لیتر محیط کشت پایه، کل مکمل محیط کشت سی _ان را به آن اضافه و پس از مخلوط کردن در پلیت های سترون تقسیم کنید. عمق محیط کشت در هر پلیت حداقل 5 میلی متر باشد.pH محیط کشت در دمای 25 درجۀ سلسیوس برابر با7.3 است.

یادآوری 1 – پلیت .های آماده شده محیط کشت سودوموناس سی – ان آگار را در تاریکی و در دمای 3+یا-5 درجۀ سلسیوس، حداکثر به مدت زمان یک ماه می.توانید نگهداری کنید.
یادآوری 2 – محیط کشت ذوب شده را نباید بیش از 4 ساعت نگهداری کرد.
یادآوری 3 – از ذوب کردن دوبارۀ محیط کشت، باید خودداری شود.

محیط کشت ستریماید آگار:

روش تهیه :

مواد فوق را با جوشاندن در آب مقطر حل و سپس در اتوکلاو با دمای 121درجۀ سلسیوس به مدت زمان 15 دقیقه سترون کنید. pH نهایی محیط کشت در دمای 25 درجۀ سلسیوس برابر با 7.2 است.

محیط کشت ام_ پی _ ای _ سی آگارmPAC

روش تهیه :

مواد فوق را با جوشاندن در آب مقطر حل و سپس در اتوکلاو با دمای 121درجۀ سلسیوس به مدت زمان 15 دقیقه سترون کنید.

مکمل محیط کشت ام_ پی _ ای _ سی آگارmPAC

روش تهیه :
مواد فوق را با رعایت شرایط اسپتیک در آب مقطر سترون حل کنید.

یادآوری – مکمل محیط کشت ام_ پی _ ای _ سی آگار نیاز به اتوکلاوکردن ندارد.

محیط کشت کامل:

روش تهیه :

محیط کشت پایه را تا دمای 45 تا 50 درجۀ سلسیوس سرد کنید . سپس با رعایت شرایط اسپتیک مکمل محیط کشت ام _ پی _ ای _ سی آگار را به آن اضافه و پس از مخلوط کردن در پلیت های سترون تقسیم کنید

pH نهایی محیط کشت در دمای 25 درجۀ سلسیوس برابر 7.2 است.

آگار مغذی:

روش تهیه :

مواد فوق را با جوشاندن در آب مقطر حل و پس از اتوکلاو با دمای 121 درج ۀ سلسیوس به مدت زمان 15 دقیقه سترون و در پلیت.های مناسب تقسیم کنید. pH نهایی محیط کشت در دمای 25 درجه سلسیوس برابر با 7.4 است.

آبگوشت استامید:

روش تهیه :
مواد فوق را در آب مقطر حل و کاملاً مخلوط کنید

هشدار – استامید ماده ای سرطان زا و تحریک کننده 1 است. بنابراین هنگام وزن کردن، آماده سازی و دفع محیط کشت باید دقت لازم به عمل آید

محلول فنل رد:

محیط کشت کامل:

روش تهیه :یک میلی لیتر محلول فنل رد  را به یک لیتر محیط کشت پایه اضافه و کاملاً مخلوط کنید . سپس محلول را در حجم های 5 تا 8 میلی لیتری د ر لوله های 121 درجۀ سلسیوس به مدت زمان 15 دقیقه سترون آزمایش تقسیم و در اتوکلاو با دمای 121 کنید.

محلول رقیق کننده:

وسایل لازم:

1.دستگاه پمپ خلاء با قدرت خلاء حدود 630 تا 635 میلی متر جیوه ( 80 تا 85 کیلو پاسکال)

2.دستگاه صاف .کن 1 شامل قیف شیشه ای یا استیل 2 مخصوص صاف .کردن، گیرۀ نگهدارنده، ارلن مایر تخلیه و لوله های وصل شونده به پمپ خلاء

3.صافی های غشایی از جنس استات.سلولز با اندازۀ روزنه 0.45میکرومتر و قطر 47 تا50 میلی متر

4.گیرۀ سر صاف

5.گرمخانۀ قابل تنظیم در دماهای 30 تا 35 درجۀ سلسیوس و 42 درجۀ سلسیوس با حد

6.حلقه کشت از جنس پلاتین – ایریدیوم  با قطرتقریبی سه میلی متر

7.لامپ فرابنفش با طول موج 360 نانومتر

روش اجرای آزمون:

آماده سازی نمونه:

به منظور توزیع یکنواخت میکروارگانیسم ها پیش از انجام .آزمون، نمونه را با تکان دادن ظرف کاملاً یکنواخت کنید . در صورتی که ظرف حاوی نمونه به صورت کامل پر باشد، ابتدا مقداری از نمونه را با رعایت شرایط اسپتیک بیرون ریخته و سپس عمل مخلوط.کردن را انجام دهید.

تمامی عملیات صاف کردن باید در مجاورت شعله و با رعایت شرایط اسپتیک انجام شود.

برای صاف .کردن نمونه، پایۀ نگه .دارنده صافی را به ارلن .تخلیه که به دستگاه پمپ خلاء 0 میکرومتر / 1)وصل شده است، متصل کرده و توسط گیره سترون، صافی غشایی 45 – (طبق بند 8 3) را روی آن قرار دهید، طوری که سطح چهارخانه صافی غشایی به طرف بالا باشد . – (طبق بند 8
سپس با رعایت شرایط اسپتیک قیف را روی پایه قرار .داده و قسمت بیرونی آن را با گیره .ای محکم کنید. در حالی که دگمه پمپ خلاء خاموش است، حجم معینی از نمونه و یا رقت .های مورد نظر را به درون قیف انتقال دهید . سپس دگمه پمپ خلاء را روشن کنید و نمونه را از صافی غشایی
عبور دهید . زمانی که حجم نمونه به کمتر از 20 میلی .لیتر رسید، دیواره های قیف را با حداقل 20 2)، شستشو دهید . به محض تمام شدن نمونه داخل قیف، – میلی.لیتر محلول رقیق کننده (طبق بند 7 پمپ خلاء را خاموش کنید.