آزمایش های میکروبیولوژِیک آب :

آزمایش های میکروبیولوژِیک آب بر اساس نیاز مورد بررسی قرار میگیرد که در این آزمایشها میزان کلی فرم موجود در آن آب اندازه گیری میگیدد

روش تخمير چند لوله اي براي باكتريهاي كلي فرم

بر اساس نظريه وايت و بردلي بيماريهاي مرتبط به آب به گروههاي زير طبقه بندي مي شوند:

1-عفونتهايي كه از طريق منابع آب منتشر مي شوند به نام بيماريهاي واتر برن

2-بيماريهاي ناشي از عدم وجود آب بهداشتي براي مصارف فردي بنام واتر واشد

3-عفونتهاي قابل انتقال توسط حيوانات آبزي يا بيماريهاي واتر بيسد

4-عفونتهاي نتشر شده توسط حشرات وابسته به آب

روش هاي طراحي شده براي ارزيابي وجود يا عدم وجود آلودگي مدفوعي از نظر بهداشت منابع آب ، اهميت ويژه اي دارند اساس اين روشها مبني بر اثبات وجود باكتريهاي انديكاتور يا شاخص است اين باكتريها به طور طبيعي پاتوژن نيستند و هميشه به مقدار زيادي در مدفوع حضور دارند شناسايي اين باكتري هاي در مقايسه با پاتوژن هاي واتر برنكه تشخيص آنها پيچيده و و قت گير است نسبتا آسان مي باشد. با توجه به اينكه در آب هاي سطحي سرد پاتوژنها سريع تر از باكتريهاي معرف از بين ميروند عدم وجود اين باكتريها يا حضور آنها به تعداد كم گوياي فقدان پاتوژنها مي باشد.در مناطق گرم پاتوژنها حتي در عدم حضور باكتريهاي معرف شناسايي شده اند كه نشان دهنده ي مقاومت اين باكتريها در محيط آبي در مقايسه با باكتريهاي معرف است اما به هر حال اين روش ها هنوز برا يارزيابي كيفيت باكتريولوژيك آب در سراسر دنيا مورد استفاده قرار مي گيرند.

باكتريهاي معرف كه در سطح وسيع به كار ميروند باكتريهاي كلي فرم هستند كه همه آنها هوازي و بي هوازي اختياري ،گرم منفي، فاقد اسپور ميله اي شكل ميباشند و در دماي 35 درجه سانتيگراد به مدت 48 ساعت لاكتوز را تخمير كرده و گاز توليد ميكنند.اين گروه شامل اشرشيا كلي و باكتري هاي نزديك به آن است كه به طور طبيعي در روده وجود دارند.مانند انتروباكترائرو جنس

علاوه بر آن برا يتاييد بيشتر استرپتوكوكها مدفوعي مانند اس فكاليس و برخي گونه هاي نزديك به آن  و گاهي در بريتانيا كلستريديم پرفرانجنس به كار گرفته ميشود در اين بحث با ساتفاده از روشهاي استاندارد ايالات متحده باكتري هاي كلي فرم شناسايي ميشوند. آزمایش های میکروبیولوژِیک آب ، روش 3 مرحله آزمايش پي در پي را در بر مي گيرد.

1-آزمايش احتمالي 2-آزمايش تاييدي 3-آزمايش تكميلي

آزمايش احتمالي:اين آزمايش روشي است برا يغني سازي باكتريهاي كلي فرم كه به ميزان كمي انتخابي مي باشند و به گونه اي طراحي شده كه ضعيف ترين سلول كل يفرم نيز قادر به رشد باشد. اين آزمايش در محيط مكانكي برات يا لاكتوز برات كه داراي لوله دورهام است انجام مي شود. در هر دو محيط قند لاكتوز وجود دارد و عامل انتخابي براي باكترهاي كلي فرم ميباشد چون اين قند توسط اين باكتريها و چند باكتري محدود ديگر تخمير مي شود. در اين روش بايد 15 لوله ي مكانكي برات هر يك داراي 10 ميلي ليتر محيط كشت آماده شود. هر لوله به ترتيب با 10ميلي ليترو 1 ميلي ليتر0.1 ميلي ليتر از آب مورد آزمايش و در شرايط استريل تلقيح مي سود. 5 لوله اي كه با 10 ميلي ليتر آب تلقيح ميشود بايد دو برابر غلضت محيط كشت داشته باشد، سپس د رداخل انكوباتور 35 درجه به مدت 24 تا 48 ساعت گذاسته ميشود پس از اين وجود گاز در لوله دورهام همراه با كدورت محيط كشت بررسي ميشود.

كدورت محيط و وجود گاز آزمایش های میکروبیولوژِیک آب :

كدورت محيط و وجود گاز، نشان دهندهي واكنش مثبت احتمالي وجود باكتري هاي كلي فرم و احتمال آلودگي مدفوعي است. كدورت تنها و بدون تشكيل گاز به عنوان واكنش مثبت ارزيابي نمي شود زيرا در اين صورت باكتريهايي رشد نموده اند كه قادر به توليد گاز نبوده و كلي فرم نمي باشند.

آزمايش تاييدي: اين آزمايش پس از واكنش مثبت آزمايش احتمالي انجام مي شود كه در آن باكترهاي رشد يافته در لوله هاي مكانيكي در محيط ديگري به نام BGLB كه انتخابي تر از مكانكي است كشت داده ميوشند. رنگ برليانت گرين و اگزال موجود در  BGLB از رشد باكترهاي غير كل يفرم ممانعت ميكند اين آزمايش در لوله هاي حاوي لوله دورهام انجام ميشود.

در اين آزمايش يك لوپ از هر لوله محيط كشت مكانكي مثبت وارد لوله هاي BGLB و سپس محيط كشت EC (ويژه كلي فرمها ي مدفوعي) مي شود. به تعداد لولهاي مثبت آزمايش تاييدي د رلولهاي BGLB و EC كشت داده ميوشد. لوله BGLB در دماي35 درجه و لوله EC و در دماي 5/44 قرار د اده مي شود كشت در محيط EC به اين منظور انجام مي شود كه ميان كلي فرم هاي با منشا مدفوعي(روده حيوانات خون گرم) و كلي فرمها ا زمنابع ديگر تمايز داده شود. اين محيط براي كلي فرمها انتخابي است. لوله هاي تلقيح شده در محيط EC به مدت 24 ساعت در انكوباتور قرار داده ميشوند تنها كلي فرمهايي با منشا مدفوعي در اين دما قادر به رشد مي باشند. عدم توليد گاز در لوله دورهام گوياي واكنش منفي است.

لوله هاي BGLB به مدت48 ساعت در انكوباتور قرار داده ميشوند. وجود گاز در لوله دورهام ، واكنش مثبت آزمايش تاييدي نشان مي دهد.

از روي جدول MPNتعداد كلي فرم ها در صد ميلي ليتر نمونه بدست مي ايد.

اين مقدار كمتر از تعداد واقعي كلي فرم در نمونه هاست دقت اين ازمايش به تعداد لولهها بستگي دارد وبيشتر كردن لوله ها اين اختلاف را كمتر مي كند نتيجه مطلوب هنگامي به دست مي آيد كه بيشترين نمونه تلقيح شده در برخي لوله ها ويا در همه لوله ها گاز توليد كرده و كمترين مقدار تلقيح شده در هيچ يك از لوله ها گاز توليد نكند. تكان دادن نمونه براي پراكنده كردن باكتري ها به طور يكسان در همه جاي نمونه در مقدار MPN تاثير دارد جدول MPN بر اساس پراكندگي تصادفي باكتري ها در نمونه تنظيم شده است.

براي برسي كيفيت باكتريولوژيك آب آشاميدني بر طبق استاندارد هاي EPAاز ده لوله ي تخميري كه به هر يك ده ميلي ليتر آب مورد آزمايش اضافه ميكنند استفاده مي شود.آزمايش تاييدي براي آب آشاميدني ودر نمونه برداري فصلي آزمايش تكميلي انجام مي شود.

آزمایش های میکروبیولوژِیک آب اساسي ترين ازمايش براي پي بردن به الودگي اب مي باشد كه در ازمايشات روزانه آب هاي آشاميدني به كار مي رود.وجود بيش از حد كلي فرم در سيستم هاي اب رساني ويا در چاه ها لزوما نشانه نقص در عمليات تصفيه نيست زيرا ممكن است كه در اثر نشت الودگي به لوله هاي اصلي وارد شود و در واقع الودگي ثانويه پيش آيد تشخيص اين موضوع كه وجود كلي فرم در اثر آلودگي جديد است ويا رشد دوباره آنها اتفاق افتاده مشكل است بنابراين وجود كلي فرم در اب آشاميدني را به صورت آلودگي جديد در نظر مي گيرند و انتظار مي رود كه 95% نمونه هاي مورد آز مايش نتيجه منفي داشته باشد براي برسي آب هاي غير ْآشاميدني (رودخانه ،چاه،استخرو…)از يك سري لوله كه با نسبت اعشاري تلقيح ميشوند استفاده مي شود. نسبت رقت به ميزان آلودگي آب مورد برسي بستگي دارد و براي آب هاي بسيار آلوده ممكن است تا 10^-25رقيق شوند.

ازمايش تكميلي : هدف از انجام ازمايش جدايي ميكروارگانيسم هاي غالب در ازمايش تاييدي است و در ان وجود كلي فرم ها به اثبات مي رسد.

در اين آزمايش از محيط انتخابي  ENDOيا EMBاگار كه حاوي قند لاكتوز است استفاده مي شو د. از محيط  BGLBبا واكنش مثبت روي EMBکشت خطي داده به مدت 24ساعت در دماي 35درجه قدار داده مي شود بعد از انكوباسيون كلني هاي زير قابل مشاهده مي باشد.تيپيك:قرمز تيره، هسته دار با جلاي فلزي يا بدون ان

آتيپيك: صورتي ،مات ،بدون هسته و موكوييدي .

چنانچه كلوني هايي غير از اين دو نوع ظاهر شوند نتيجه آز مايش منفي است .در صورت وجود كلوني هاي تيپيك يك كلني ايزوله را بايد به لوله ي حاوي لاكتوز برات ونيز به لوله ي كشت پپتون اگار يا نو ترينت اگار اسلنت تلقيح كرده ودر حرارت 35درجه قرار داد بعد از 24-48 ساعت در صورت وجود گاز در لاكتوز برات و بررسي ميكروسكپي از پپتون اگار و وجود باكتر يهاي ميله اي شكل گرم منفي و بدون اسپور ازمايش تكميلي مثبت ارزيابي ميشود.

تشخيص E.COLI از ساير كلي فرم ها با استفاده از آزمايش IMVIC

I = Indol     M =  Methyl Red  V =  Voges-Proskauer  C= Citrat

در بعضي موارد تشخيص و تعيين اينكه كدام باكتري كلي فرم، منجر به نتايج مثبت آزمايش تكميلي شده، اهميت دارد. بخصوص د رشبكه هايي كه آب شرب، فقط توسط فيلتر شني تصفيه شده و كلرزني انجام نمي گيرد ، با افزايش ناگهاني در آزمايشهاي تكميلي مثبت ، بررسي آلودگي مدفوعي اهميت مي يابد. در اين مجموعه آزمايشها، E.coli از باكتري E.aerogenes تشخيص داده مي شود. هر دو باكتري ، باسيلهاي كوتاه ، فاقد اسپور گرم منفي و متحرك بوده هنگام تخمير كربوهيدارتها ، اسيد و گاز توليد مي كنند و قادر به تخمير لاكتوز مي باشند.

اساس تشخيص دو باكتري  آزمایش های میکروبیولوژِیک آب ، فراورده هاي نهايي متفاوت حاصل از تخمير گلوكز مي باشد ، كه ناشي ا زتفاوت آنزيمي آنها است كه در تست IMVIC بررسي مي شود. تجزيه گلوكز و توليد پيروات مشابه ولي از پيروات به بعد تفاوتهايي را به صورت زير نشان ميدهند:

1-E.coli ، H2 و دي اكسيد كربن را به يك اندازه ، ولي انتروباكتر دي اكسيد كربن بيشتري توليد ميكند.

2-E.coli از هر مول گلوكز مقدار اسيد بيشتري نسبت به انتروباكتر توليد ميكند.

3-بر خلاف E.coli انتروباكتر توليد بوتيلن گليكول و استيل متيل كربونيل ميكند.

4-E.coli بر خلاف انتروباكتر از تريپتوفان توليد اندول ميكند

5-انتروباكتر بر خلاف E.coli از سيترات به عنوان تنها منبع انرژي و كربن استفاده ميكند.

تست IMVIC :

اندول

از لوله لاكتوز برات كه حائي كشت خالصي از باكتري  مورد نظر است ، يك لوپ در محيط آزمايش اندول حاوي 1% باكتوتريپتون كه داراي مقادير قابل توجهي تريپتوفان مي باشد وارد كنيد سپس آن را به مدت 24 ساعت در دماي 35 درجه قرار دهيد چند قطره معرف كواك به محيط كشت اضافه كنيد. بعد از چند دقيقه در صورت وجود اندول روي سطح محيط حلقه قرمز رنگي مشاهده مي شود براي گزارش نتيجه منفي بايد 10 تا 15 دقيقه منتظر ماند. تنيجه آزمايش بايد پس از حداكثر 48 ساعت انكوباكسيون خوانده شود زيرا در اثر طولاني شدن مدت انكوباكسيون ممكن است خود اندول تجزيه شود و در تنيجه جواب منفي كاذب گرفته شود. براي آزمايش اندول علاوه بر تريپتون برات از محيطهاي SIM و INM نيز مي توان استفاده كرد كه در اين صورت با فيلدو پلاتين سوزني به صورت عمودي تا نيمه محيط كشت داده مي شود.

MRVP

قبل از انجام آزمايش متيل رد و وي پي محيط كشت را به دو قسمت تقسيم مي كنيم.

واكنش متيل رد از باكتري مورد نظر درمحيط MRVP كشت داده و در دماي 35 درجه قرار دهيد. بعد از 5 روز ، 5 قطره معرف متيل رد اصافه كنيد د رصورت وجود  اسيد محيط به طور يكنواخت قرمز ميشود  در حالي كه رنگ زرد واكنش منفي را نشان مي دهد.

واكنش VP

از باكتري مورد نظر در محيط MRVP  كشت دهيد و لوله را در حرارت 35 درجه در مدت 48 ساعت قرار دهيد. معرف VP (5/ سي سي پتاس 40%،5/1 سي سي محلول آلفا نفتول) به محيط كشت بيافزاييد بعد از مخلوط كردن و پس از طي 10 تا 30 دقيقه رنگ قرمز محيط گوياي توليد استوئين يا استيل متيل كربونيل مي باشد.

آزمايش سيترات

آزمايش سيترات آزمایش های میکروبیولوژِیک آب بر اساس توانايي باكتري در استفاده از سيترات به عنوان تنها منبع كربن و انرژي استوار است باكتري را د ر محيط سيترات كشت دهيد پس از مدت 48 ساعت انكوباكسيون در دماي 35 درجه اگر محيط از سبز به آبي تغيير رنگ دهد نشانه واكنش مثبت است.

اغلب سوش هاي اين دو باكتري خاصيت حدواسط دو باكتري رادارند بسياري ا زياين سوش هاي حد واسط ممكن است در روده انسان يافت شوند.

سيمون سيترات منفی                                          سيمون سيترات مثبت

نتایج مختلف ممکن برای هرقسمت آزمایش:

آزمایش MPN

آزمایش HPC

شمارش باکتری های آب :

مقادیر زیاد باکتری حتی در صورت غیر بیماریزا بودن نشاندهنده مقادیر قابل ملاحظه مواد آلی قابل تجزیه است که با رشد در دیواره ها منجر به کاهش توانایی انتقال آنها می شوند.

روش کار:

آزمایش های میکروبیولوژِیک آب تعداد کل میکروب های موجود در واحد حجم آب نمونه بررسی می شود و روش استاندارد کشت در محیط pca در شرایط هوازی،به مدت 3 روز در دمای 35 درجه سانتی گراد به کار می رود.هر پلیتی که بیش از 300 کلنی داشته باشد نمی توانیم شمارش کنیم.

روش آزمایش های میکروبیولوژِیک آب  همه میکروبهایی را که نمی توانند تحت این شرایط رشد کنند مانند بی هوازی های اجباری حذف می کند.چنانچه این آزمایش به طور روتین از لحاظ بهداشت عمومی انجام می گیرد،معیار معتبری برای ارزیابی فرآیند تصفیه و سیستم انتقال آب می باشد. آزمایش IMViC

منابع:

جزوه درسی آزمایشگاه میکروبیولوژی دکتر پروین شاکری