اسپکتروفتومتر

آنالیز دستگاهی دستگاه اسپکتروفتومتر

آنالیز دستگاهی دستگاه اسپکتروفتومتر
اسپکتروفتومتر یا طیف سنج، دستگاهی است که شدت نور را به صورت تابعی از طول موج اندازه گیری می کند. این کار با انکسار پرتو نور به طیف طول موج ها و آشکارسازی شدت ها با دستگاه باردار و نمایش نتایج به صورت گراف انجام می شود. در حقیقت این روش با استفاده از میزان جذب نور، تعیین غلظت فاضلاب می کند. این روش قابلیت اندازه گیری نمونه های فوق العاده کوچک را داشته لذا از آن برای تجزیه و تحلیل عناصر مولکول های RNA، DNA استفاده می شود.

نور از بسته های بسیار کوچکی به نام فوتون تشکیل شده است که انرژی هر یک از آنها به محض برخورد به یک الکترون منتقل می شود. تنها هنگامی انتقال رخ می دهد که انرژی فوتون ها برابر با انرژی مورد نیاز برای انتقال الکترون به لایه انرژی بعدی باشد. این پروسه که در آزمایش های محاسبه کیفیت و کمیت DNA موجود در محلول ها استفاده می شود، پایه طیف بینی جذبی را تشکیل می دهد. به طور کلی نور با طول موج و انرژی خاص به نمونه تابانده شده و مقدار مشخصی از انرژی آن جذب می شود. سپس با اندازه گیری انرژی رد شده از نمونه توسط یک فوتودتکتور، مقدار جذب تعیین می شود. اسپکتروفتومتر دستگاه پیچیده ای است که شدت نور را به صورت تابعی از طول موج اندازه گیری می کند. در این دستگاه نور توسط یک منبع نور تولید شده و پس از گذشتن از میان نمونه مورد نظر نور، به صورت طیفی منتشر می شود سپس به وسیله سنسور ها آشکارسازی شده و به صورت نتایج قابل کاربردی ترجمه می شود. خروجی اسپکتروفتومتر همیشه نموداری از شدت نور نسبت به طول موج است. داده هایی که برای تولید نمودار گردآوری شده، در جدولی از شدت نور و طول موج ذخیره می شود. مقدار گراف بیان کننده مقدار عبور یا مقدار جذب است. اسپکتروفتومتر های امروزی دیجیتالی بوده و به وسیله میکروپروسسور کنترل می شوند.

اجزا اسپکتروفتومتر
چهار بخش اصلی در اسپکتروفتومتر وجود دارد: منبع نور، نمونه، آشکارساز و مفسر.
منبع نور می تواند نور مرئی، مادون قرمز یا ماورا بنفش باشد. پس از منبع نور یک تک فام ساز (مونوکروماتور) وجود دارد تا نور تولید شده را فیلتر و توسط یک منشور یا توری پراش طول موج های خاصی را انتخاب کند. پس از گذشتن نور تولید شده از داخل نمونه و جذب بخشی از آن، پس از گذشتن از مجموعه ای از لنز ها، شکاف ها، آینه ها و فیلتر ها به سنسور ها رسیده و پس از تفسیر شدن به صورت نموداری در خروجی قرار می گیرد.

عملکرد دستگاه

مسیر نور
در حال حاضر دو منبع نور UV و VIS برای اسپکتروفتومتر وجود دارد. متداول ترین منبع نور برای تولید نور مرئی یک لامپ هالوژن تنگستن با طول موج بین ۲۰۰ و ۳۴۰ نانومتر است. نور از میان نمونه عبور کرده و از طریق شکافی وارد اسپکتروفتومتر می شود. شکاف نازک باعث پراکنده شدن نور و پخش به خارج می شود، از آنجا که دستگاه ها تنها یک باریکه نور دارند، در بیشتر موارد طول موج پرتو خوانده شده از نمونه دستخوش تغییر واقع می شود و برای اصلاح این امر از آینه های مقعر استفاده می شود. بدین ترتیب که نور توسط آینه های مقعر به شبکه پراکنده کننده منعکس شده و دوباره به آینه مقعر دیگری منعکس می شود. این آینه کانونی نور را به سمت آشکارساز متمرکز می کند.

آینه هایی که امروزه مورد استفاده قرار می گیرند به سه دسته تقسیم می شوند. اولین دسته از شیشه ساخته شده و برای خواندن جذب در طول موج های UV بیشتر از ۳۴۰ نانومتر استفاده می شود. دسته دوم از سیلیس گداخته یا کوارتز ساخته شده و به علت شفافیت بسیار زیاد می تواند در اندازه گیری جذب طیف های UV و VIS (800-200 نانومتر) استفاده شود و نوع سوم آینه های یک بار مصرف است که انواع مختلفی دارد. یک نمونه از آن از پلی متا اکریلیت بوده و تنها برای اندازه گیری طول موج های ۲۸۰ تا ۸۰۰ نانومتر استفاده می شود.
طبق آخرین تحقیقات آزمایشگاهی، منبع UV می تواند لامپ هیدروژنی فشار بالا یا لامپ دوتریوم باشد. هنگامی که میزان جذب در طیف UV اندازه گیری می شود، لامپ دیگر خاموش می شود و زمانی که اندازه گیری جذب در نور مرئی انجام می شود برعکس این مساله اتفاق می افتد که دلیل این امر جلوگیری از تداخل طول موج های غیر ضروری در نور منتشر شده از نمونه است.

آشکار ساز
در انتهای مسیر نور، آشکارساز وجود دارد که وظیفه آن اندازه گیری شدت نور تابیده شده از آینه ها و انتقال اطلاعات به کنتوری است که آنها را ثبت و مقدار را بر روی LCD به اپراتور نمایش دهد. امروزه دو نوع آشکارساز در اسپکتروفتومتر UV / VIS متداول است : فتوتیوب و فتومالتی پلایر تیوب.

فتوتیوب یا فتوسل با تولید یک جریان الکتریکی عمل می کند. وقتی یک فوتون به کاتد سلول ضربه بزند، الکترون به سمت آند رانده شده و بدین ترتیب جریان الکترونی به وجود می آید که مقدار آن به میزان انرژی فوتون بستگی دارد. تیوب فتومالتی پلایر که بسیار حساس تر است به قانون اثر فتوالکتریک پلانک استناد دارد. فوتون ها به سطح حساس تیوب ضربه زده و الکترون های اولیه را به حرکت در می آورند، با برخورد این الکترون ها با سطح بعدی الکترون های ثانویه نیز رها می شوند. این روال به همین ترتیب ادامه پیدا می کند تا به آند برسند و جریان الکتریکی راه بیفتد. جریان تولید شده چندین بار تقویت می شود تا بتواند انرژی بسیار پایین یک فوتون را آشکار سازی و ثبت کند.

دستگاه باردار (CCD)
آشکارساز در بیشتر اسپکتروفتومتر ها یک دستگاه باردار خطی(CCD) است. CCD نوعی سنسور است که نور را حس می کند و از مدار های مجتمعی مشتمل بر جفت خازن های کوپل شده حساس به نور تشکیل شده است. این خازن ها شدت نور دریافتی را حس کرده و آن را به سیگنال الکتریکی تبدیل می کند. آشکار ساز خطی CCD مشابه دامنه طول موج ها در اسپکتروفتومتر دستی است. هر پیکسل در CCD نشان دهنده طول موج خاصی از نور است و فوتون های جذب شده بیشتر، سیگنال های الکتریکی بیشتری تولید می کند. بنابراین سیگنال های الکتریکی خروجی CCD در هر پیکسل، برابر نسبت شدت نور در طول موج متناظر است.

مفسر
اسپکتروفتومتر ها می توانند خروجی خود را به صورت های مختلف نمایش دهند، اما متداول تر است که آن را به کامپیوتر وصل کرده و برای آنالیز داده ها از نرم افزار استفاده کنند و آن را به صورت قابل کاربردی مانند نموداری از مقدار عبور یا مقدار جذب برحسب طول موج نمایش می دهند.

انواع دیگر اسپکتروفتومتر ها

تک پرتو و دو پرتو
اسپکتروفتومتر ها به دو دسته تقسیم می شوند : تک پرتو و دو پرتو.
اسپکتروفتومتر های تک پرتو اولین نسل اسپکتروفتومتر ها بوده و تمام نور از بین نمونه عبور می کند، در این نوع برای اندازه گیری شدت نور تابشی باید به این نکته توجه داشت. این اسپکتروفتومتر ها ارزان هستند چرا که بخش های کمتری داشته و سیستم آنها پیچیدگی کمتری دارند. نسل جدید اسپکتروفتومتر ها نوع دو پرتو است. در این نوع نور قبل از این که به نمونه برسد به دو پرتو مجزا تفکیک می شود که این مسئله یک امتیاز تلقی می شود زیرا خواندن منبع و نمونه به طور همزمان انجام می شود. در برخی از اسپکتروفتومتر های دو پرتو، دو آشکارساز وجود دارد بدین ترتیب امکان اندازه گیری همزمان پرتو های نمونه و مرجع فراهم می شود. سایر اسپکتروفتومتر های دو پرتو، که تنها یک آشکارساز دارند از برشگر پرتو استفاده می کنند که این وسیله در هر لحظه یک پرتو را سد کرده و آشکارساز اندازه گیری پرتو نمونه و مرجع را به صورت یک در میان انجام می دهد.

نور مرئی
محدوده نور مرئی حدود ۷۰۰-۴۰۰ نانومتر است. اسپکتروفتومتر های ناحیه مرئی دقت و صحت متغیری دارند. برخی از آنها آشکارساز CCD با پیکسل های کافی برای قرائت هر nm10 را دارند، در حالیکه برخی دیگر می توانند در هر نانومتر چندین قرائت انجام دهند. این اسپکتروفتومتر ها می توانند از منابع نور سیمابی، هالوژن، LED یا ترکیبی از این منابع مثل LED تقویت شده با رشته های تنگستن استفاده کنند.

نور ماورا بنفش

Spectrophotometry

اسپکتروفتومتر هایUV علاوه بر اینکه در طیف سنجی مایعات بسیار متداول است، برای گاز ها و همچنین جامدات نیز استفاده می شود. نمونه را در محفظه مستطیلی مخصوص که معمولا یک سانتیمتر پهنا دارد قرار می دهند. این محفظه که کاوت(Cuvvette) نامیده می شود می تواند شکل پلاستیک، شیشه یا کوارتز داشته باشد. پلاستیک و شیشه، UV را جذب می کنند از اینرو تنها می توان آنها را برای اسپکتروفتومتر های نور مرئی استفاده کرد.

نور مادون قرمز
اسپکتروفتومتر مادون قرمز در شناسایی مولکولی و ارتعاشات وابسته به ساختار آن استفاده می شود. ساختار های شیمیایی متفاوت، به دلیل تفاوت در انرژی های مربوط به هر طول موج، راه های مختلفی در پاسخ به طول موج های مختلف دارند. به عنوان مثال مادون قرمز های برد متوسط، تمایل به لرزش دورانی دارند، در حالیکه مادون قرمز نزدیک(با انرژی بالا) تمایل به لرزش هارمونیک مولکولی مانند جنبش دارد. در اسپکتروفتومتر های IR متداول یک پرتو مادون قرمز مستقیما به نمونه می تابد و تمام طول موج های طیف نسبت به پرتو مرجع اندازه گیری می شود. به منظور تولید طیفی با کیفیت بالا، باید پهنای طیف ورودی به آرامی اسکن شود. اسپکتروسکوپی IR با روش بسط تبدیل فوریه اصلاح می شود. قلب اسپکتروفتومتر های IR، تداخل سنج میشلسون است. نور تابش شده از منبع IR به سمت سلول های نمونه هدایت می شود. نیمی از پرتو تابشی از آینه ثابت باز تابیده شده و نیم دیگر آن از آینه ای که مرتبا در فاصله ای حدود ۵/۲ میکرومتر حرکت می کند منعکس می شود. هنگامی که دوباره دو پرتو در آشکارساز با هم ترکیب می شوند و تداخل به وجود می آید، حدود دو ثانیه یک اسکن از فاصله ورودی گرفته شده و در کامپیوتر ذخیره می شود. به همین ترتیب چندین اسکن دیگر نیز به طور همزمان به آن اضافه می شود. با توجه به نوسانات و ارتعاشات حرارتی در آزمایشگاه بدیهی است که این امر ناممکن است. پس به منظور حل این مشکل از لیزر هلیم-نئون برای تاباندن به تداخل سنج میشلسون استفاده می شود و تداخل لیزر به عنوان فرکانس مرجع به کار گرفته می شود. کارائی FTIR از دستگاه های معمولی بیشتر است که می توان تنها با مقدار کمی از نمونه و در زمانی کوتاه به طیفی عالی دست یافت.

استفاده از اسپکتروفتومتر
اسپکتروفتومتر ها مستقیما برای اندازه گیری شدت نور در طول موج های مختلف استفاده می شود و می تواند نماینده در صد نور تابشی مخابره شده یا جذب شده باشد. با استفاده از این اطلاعات و مقایسه آن با دانسیته ها و داده های به دست آمده می توان اسپکتروسکوپی را به عنوان یک ابزار استفاده کرد. مقایسه طیف ها برای تعیین غلظت جسم حل شده موجود در حلال مثال خوبی است. بدین ترتیب که با ثبت نور ارسال و دریافت شده در طول موج خاص و بررسی طول موج جذب شده توسط حلال می توان به غلظت آن پی برد. سپس آنالیز محلول با غلظت ناشناخته، با داده های معلوم مقایسه شده و به کمک تناسب غلظت محاسبه می شود. این عمل برای محلول هایی که در آنها چندین نوع حلال وجود دارد نیز قابل استفاده است و البته به دقت بیشتری در آنالیز طول موج ها احتیاج دارد. با توجه به حساسیت اسپکتروفتومتر FTIR مناسب ترین و رضایت بخش ترین روش آماده سازی نمونه، تبخیر ساده محلول نمونه در صفحه ای از نمک KBr و دست یافتن به طیف های فیلم نازک باقی مانده است. این روش طیفی بسیار خوب با خط مبدا مسطح به وجود می آورد.

اسپکتروفتومتر هایی که منبع نور ندارند اما طیف هایی مبنی بر نور وارده را تولید می کنند می توانند با روشی مشابه برای تعیین منبع نور استفاده شوند. می توان منحنی طیف های به دست آمده از منبع نوری نامعلوم(یا تر کیبی از منابع) را با اطلاعات منحنی های منبع نور مشخصی مقایسه کرد و منبع نور ناشناخته را شناسایی کرد.
از دیگر کاربرد های اسپکتروفتومتر می توان به تعیین ثابت موازنه واکنش های یونی که در محلول های آبی انجام می شود اشاره کرد. در ابتدا طیف های محلولی که تنها شامل یک واکنش دهنده است اندازه گیری می شود. سپس دیگر واکنش دهنده ها به آن اضافه می شود و پس از هر بار افزایش، طیف سنجی صورت می گیرد. این روش در صورتی به طور مطلوب کار می کند که طول موج جذب شده توسط محصول مقداری مشخص باشد. از آنجا که بیشتر محصولات از اضافه کردن چندین واکنشگر به دست می آیند، زمانی که محلول اشباع شده و واکنش موازنه می شود نور های بیشتری جذب شده و افزایش نور جذب شده برابر ثابت موازنه است.

در هنگام نصب دستگاه اسپکتروفتومتر باید به نکات زیر توجه داشت :
۱- اسپکتروفتومتر باید روی سطحی سفت و در محیطی خشک و تمیز نصب شود.
۲- به جهت امکان جریان هوا در اطراف اسپکتروفتومتر، باید بین دستگاه و دیوار های اطراف ۵۰ میلیمتر فاصله باشد.
۳- کابل برق دستگاه به پریز گراند شده با ولتاژ مناسب وصل شود.
۴- پس از اتصال آداپتور AC به برق، خروجی آن باید به گونه ای به دستگاه وصل شود که منبع ذخیره DC در مسیر آن قرار گیرد.
۵- در صورتی که خود دستگاه فاقد پرینتر است، باید از طریق پورت مخصوص آن را به پرینتر وصل کرد.
۶- پس از روشن کردن دستگاه مدتی صبر کرده تا دستگاه گرم شده و به پایداری حرارتی و الکترونیکی برسد