روش آزمایش میکروبی آب

شناسایی و تعیین فراوانی باکتری های کلیفرم

دو روش استاندارد و متداول برای شناسایی و تعیین فراوانی باکتری های کلیفرم، روش صافی غشایی و روش تخمیر چند لوله ای هستند.روش آزمایش میکروبی آب به طور عمده جهت شناخت وضعیت بهداشت آب صورت می گیرند. روش های متداول در آزمایشگاه تعیین کننده میزان حقیقی میکروارگانیسم های آب نیستند. دلیل عمده این امر این است که تمام میکروارگانیسم های موجود در آب قادر به استفاده از محیط کشت های مصرفی بعنوان منبع تولید کننده انرژی نمی باشند. همچنین بعلت تعداد کم میکروارگانیسم ها (در آب های آشامیدنی) شناسایی و جداساختن آنها از آب بسیار مشکل بوده و از روش های معمولی آزمایشگاهی نمی توان وجود همه آنها را پی گیری نمود.

روش صافی غشایی

در آزمایش صافی غشایی، حجم مشخصی از نمونه آب از یک صافی غشایی (معمولا با اندازه منافذ 0.45 میکرومتر ) عبور داده می شود تا باکتری ها روی صافی بمانند. سپس صافی را در بشقابک ازمایشگاهی حاوی محیط کشت مناسب برای رشد باکتری های کلیفرم قرار داده، آن را به مدت 24 ساعت در انکوباتور در دمای 0.5  ± 35 نگه داشته، تا کلنی های میکروبی تشکیل و شمارش شوند.

در آزمایش صافی غشایی ، حجم مشخصی از نمونه ای که صاف می شود، به فراوانی باکتری­های موجود در نمونه بستگی دارد. معمولا برای آب آشامیدنی از 100 میلی لیتر نمونه، ولی برای آب ­های آلوده تر و کدرتر از حجم کمتری استفاده می شود؛ به طوری که بیش از 50 کلنی کلیفرم در هر بشقابک آزمایشگاهی تشکیل نشود. در این آزمایش، فراوانی کلیفرم­ ها بر حسب یکای کلنی ساز (CFU) بر حجم (معمولا CFU/100 mL) گزارش می شود. علت به کار بردن CFU به جای تعداد کلیفرم­ها، عدم قطعیت از تشکیل هر کلنی توسط فقط یک باکتری زنده است، زیرا ممکن است هر کلنی از چند باکتری زنده تشکیل شده باشد. پس از شمارش تعداد کلنی­های تشکیل شده مجزا، فراوانی کلیفرم­های نمونه آب از رابطه زیر به دست می ­آید:

که در آن V حجم آب صاف شده (mL) است.

روش تخمیر چند لوله ای

در آزمایش تخمیر چند لوله ای، از ویژگی کلیفرم­ ها در تخمیر لاکتوز و تولید گاز استفاده می­ شود. در این آزمایش، نمونه لوله آزمایش حاوی محیط کشت لاکتوزدار منتقل و سپس به مدتh  3± 48 در دمای 0.5  ± 35 در انکوباتور نگه داری می ­شود. پس از انکوباسیون، وجود گاز در لوله آزمایش معرف وجود باکتری­های کلیفرم در آن است.

در این آزمایش معمولا چند مرحله رقیق سازی متوالی، با ضریب توالی 10، انجام می­گیرد. برای مثال، اگر حجم­ه ای 10، 1 ml 0.1 از نمونه اصلی را با آب مقطر به حجم ml  100 برسانیم، سه نمونه رقیق شده متوالی از نمونه اصلی با ضرایب رقیق سازی 10، 100 و 1000 به دست می ­آید، به طوری که ضریب رقیق سازی در n امین مرحله ⁿ10 است. در عمل، معمولا سه نمونه رقیق شده و پنج تکرار از هر نمونه (جمعا 15 لوله  آزمایش) استفاده می­ شود. لوله­ های آزمایش، هم زمان به مدت 3± 48 در دمای 0.5  ± 35 در انکوباتور نگه داری می ­شوند، تا پس از انکوباسیون لوله­ های مثبت (گازدار) مشخص شوند. هر چه تعداد نمونه­ های رقیق شده و نیز تعداد تکرار از هر نمونه بیشتر باشد، فراوانی کلیفرم­ ها با نتیجه دقیق ­تری به دست می­ آید. آزمایش تخمیر چند لوله ­ای در سه مرحله:

1. احتمالی
2. تاییدی و تکمیلی صورت می­گیرد.

با این آزمایش علاوه بر تعیین فراوانی کل کلیفرم­ ها، می ­توان فراوانی گونه ­های خاص کلیفرم، همچون کلیفرم مدفوعی و E.Coli را نیز مشخص کرد.

در روش تخمیر چند لوله ­ای، فراوانی کلیفرم ­ها، بر اساس نظریه احتمالات، معمولا به صورت محتمل ­ترین تعداد در mL100 (MPN/100ml) گزارش می­ شود.  در واقع، MPN معرف تعداد دقیق کلیفرم ­ها در نمونه نیست، بلکه برآورد آماری از بیشترین احتمال تعداد آنها و بر مبنای احتمال توزیع پواسون استوار است. برای سه مرحله رقیق سازی و پنج تکرار، احتمال وقوع یک نتیجه خاص، بر مبنای توزیع پواسون ، از رابطه زیر به دست می­ آید:

که در آن، y احتمال وقوع یک نتیجه خاص، α ثابت حجم نمونه در هر لوله آزمایش در هر مرحله رقیق سازی (mL)، N فراوانی کلیفرم­ها در واحد حجم، P تعداد لوله­ های مثبت (گازدار) و q تعداد لوله­ های منفی (بدون گاز) در هر مرحله رقیق سازی است. در این رابطه، آن مقدار از N که بیشترین مقدار ازyα را نتیجه دهد، معرف MPN در واحد حجم خواهد بود. برای گزارش فراوانی کلیفرم­ها بر حسب MPN/100mL باید نتیجه به دست آمده از معادله بالا را در عدد 100 ضرب کرد.

، جدول زیر ، مقادیر MPN/100 mL به دست آمده از توزیع پواسون، معادله بالا، برای سری حجم­ های . و  هر کدام با پنج بار تکرار، ارائه شده اند. اگر نمونه­ های آزمایش شده، رقیق تر از نمونه ­های جدول زیر باشند، باید مقدار قرائت شده از این جدول را در ضریب تصحیی رقیق سازی ضرب کرد، که این ضریب برابر است با حاصل تقسیم حجم نمونه در جدول بر حجم نمونه آزمایش شده، برای مثال، اگر در آزمایش از سری حجم­های100، 10 و 1 میلی لیتر استفاده شده باشد باید مقدار قرائت شده از جدول را با اعمال ضریب 0.1=10/100اصلاح کرده به طور مشابه اگر از سری حجم های 1، 0.1 و 10.1 میلی لیتر استفاده شده باشد باید مقدار قرائت شده از جدول را با اعمال ضریب 10=1/10 اصلاح کرد. اگر بیش از سه نمونه رقیق شده استفاده شود، برای استفاده از جدول زیر ، باید از نتایج سه نمونه رقیق شده متوالی استفاده کرد، در این راستا، بهتر است از نتایج نمونه شروع کرد که اگر تمام لوله ­های آن مثبت بودند، تمام لوله های نمونه بعدی مثبت نباشند. در ضمن اگر در بین لوله ­های نمونه هایی که بیشتر رقیق شده اند (یعنی چهارمین و پنجمین مرحله رقیق سازی ) هنوز لوله مثبت وجود داشته باشد، باید تعداد لوله­ های مثبت آن به تعداد لوله­ های مثبت سومین مرحله رقیق سازی (تا سقف 5) افزوده شود.

از رابطه زیر موسوم به معادله توماس نیز می توان فراوانی کلیفرم ها را با تقریب قابل قبول به دست آورد.

که در آن سیگما پی آی  تعداد لوله های مثبت در تمام نمونه ها،  سیگما وی مجموع حجم های نمونه ها در کل لوله های منفی (بدون گاز) (mL) و سیگما وی آی مجموعه حجم های نمونه ها در تمام لوله ها (mL) است. در کاربرد رابطه توماس، بهتر است که از نتایج اولین نمونه که تمام لوله های آن مثبت باشد، صرف نظر کرد.

فاضلاب ها و آب های آلوده را که باکتری های مولد بیماری در آنها یافت می شوند می توان براحتی مورد آزمایش قرار داده و میکروارگانیسم های آنرا شناسایی و از آب جدا نمود. به طور عمده سه گروه باکتری در صورت راه یافتن به اندام های گوارشی انسان و حیوانات (از طریق آب) قادر به فعالیت و ایجاد ناراحتی می باشند.

• کلی فرم ها و باکتری های وابسته
• باکتری های مولد هاگ (اسپور) تخمیر کننده قند لاکتوز
• استرپتوکوک های مدفوع
  

از سه گروه یاد شده در بالا، کلی فرم ها از اهمیت بیشتری نسبت به سایر باکتری ها در آب برخوردار بوده و بعنوان شاخص بهداشتی آب بشمار می روند. باین صورت که وجودشان در آب نشانه آلودگی و عدم وجوشان دلیل برپاک و بهداشتی بودن آب می باشد.

علل عمده این امر این است که کلی فرم ها ارتباط های بسیار نزدیکی با باکتری های بیماری زا گوارشی نظیر باکتری های مولد مسمومیت های غذائی، اسهال خونی، تیفوئید از نظر هم خانواده بودن با این باکتری ها دارند و از طرف دیگر دیده شدن کلی فرم ها در کنار استرپتوکوک های موجود در مدفوع انسان ها و حیوانات نشان دهنده همکاری و ارتباط این باکتری ها با استرپتوکوک های مدفوع می باشد. از این نظر اعمالی که به طور طبیعی و یا مصنوعی در طی ذخیره شدن آب در منابع، رسوب دادن و کلرزدن و سایر کارهائیکه جهت خالص (صاف) کردن و یا بهداشت آب صورت می گیرد، تا اندازه ای روی کلی فرم ها نیز اثر میگذارد. بهر حال به طور کلی می توان گفت عدم وجود کلی فرم ها در آب، دلیل بر عدم وجود باکتریهای بیماریزا (پاتوژن) روده ای می باشد.

کلی فرم ها به دو نوع مشخص اشرشیا-Escher coli و اروباکتر Aerobacterتقسیم می شوند. کلی فرم ها باکتریهایی هستند، باسیلی شکل، هوازی و غیر هوازی اختیاری گرم منفی، مزوفیل و بدون هاگ (اسپور) که قادرند لاکتوز را تخمیر نموده و گاز تولید نمایند.

تولید گاز در روش آزمایش میکروبی آب

در آزمایشهای باکتریولوژی که جهت شناخت کلی فرم ها صورت می گیرد. اولین مرحله تولید گاز در محیط لاکتوزبراث است. تولید گاز تنها احتمال وجود کلی فرم را در آب تقویت می کند، زیرا باکتری های دیگری نظیر باکتریهای هاگ دارهوازی و غیر هوازی نیز قادر به تولید گاز می باشند. حتی ممکن است در محیط لاکتوز براث کلی فرم ها قندلاکتوز را به قند ساده تری مانند گلوکز تجزیه کننده و باکتری های دیگر با مصرف و تجزیه گلوکز، گاز تولید نمایند.
با دانستن مکانی که نمونه آب از آنجا تهیه شده است می توان تا حد زیادی باکتریهای آنرا شناسایی کرد. چنانکه در فاضلاب ها و آبهای آلوده وجود کلی فرم ها کاملا قطعی است و در آب های مصرفی، آب استخرها و آب های کلرزده، وجود باکتری های هاگ دار بعلت مقاومت زیاد آنها در برابر کلر محتمل تر می باشند. تولید گاز توسط باکتری را معمولا در مدت زمان حداکثر 84ساعت و در حرارت 33 ºCمورد آزمایش و بررسی قرار می دهند.

رشد هوازی

باکتریهای کلی فرم قادرند در روی محیط کشت های جامد به طور هوازی رشد نمایند. محیط کشت هایی که در این مورد از آنها استفاده می شود عبارتند از: ائوزین متیلن بلو آگار (Eosin Methylene Blue Agar)و همچنین اندوآگار (Endo Agar)چون خصوصیات پرگنه های مربوط به کلی فرم ها در این محیط کشت ها مشخص می باشد. چنانچه نحوه کشت به طور صحیح صورت می گیرد در صورت وجود کلی فرم در نمونه آب میتوان وجود آنرا کاملا شناسایی کرد. همچنین در محیط های یاد شده از رشد باکتریهای هاگ دار غیر هوازی جلوگیری می شود. وجود معرف های رنگی از قبیل ائوزین ( Yزرد) و متیلن بلو محیط کشت را جهت رشد سایر باکتریهائی که مورد نظر نیستند نامناسب می سازد.

روش نمونه برداری میکروبی آب

در نمونه برداری از آب های مختلف چند اصل مهم را باید رعایت نمود. این اصول را می توان بقرار زیر شرح داد.

• ظروف مورد استفاده جهت نمونه برداری حتی الامکان درب دار و استریل باشند.
• نمونه برداری در روز انجام آزمایش ها و حداکثر بفاصله چند ساعت تا انجام آزمایش میکروبی صورت گیرد.
  
• سعی شود، نمونه به طور صحیح و کامل با آزمایشگاه تحویل گردد.
  
• در هنگام نمونه برداری از آبهای جاری (رودخانه) و ساکن (دریاچه) دقت شود که دهانه ظرف نمونه برداری در زیر سطح آب قرار گیرد تا از نفوذ عوامل سطحی آب جلوگیری شود.
  
• در نمونه برداری از آب لوله کشی، ابتدا قدری شیر آب را باز نموده تا آب ساکن داخل شیر جریان یابد و سپس بعد از پاک نمودن آلودگی سطحی شیر توسط شعله چراغ (چراغ الکلی) با باز نمودن دوباره شیر و درب ظرف نمونه برداری موجب پر شدن ظرف از آب مورد نظر گردید .