تعیین کلونی و ثبت نتايج
تعیین کلونی و ثبت نتايج:
بلافاصله پس از پايان مدت گرماگذاري در انکوباتور ، تعیین کلونی را انجام دهيد. چنانچه اين كار امكان پذير نباشد، مي توانيد پليت ها را حداكثر تا 24 ساعت در دماي 10 درجه در يخچال نگه داري كنيد . با كمك يك كلني شمار مدرج با بزرگ نمايي مناسب كه مي تواند از انواع ساده تا دستگاه هاي اتوماتيك با صفحه تلويزيون باشد شمارش را انجام دهيد. بايد توجه داشته باشيد كه به هنگام آماده سازي پليت ها و كشت ميكروبي،حجم نمونه ها را طوري انتخاب كنيد كه براي شمارش نهايي حدود 30 تا 300 كلني در هر پليت تشكيل گردد . هدف اين است كه در حداقل يك پليت حاوي نمونه رقيق شده بتوان تعداد كلني هايي در دامنه فوق را مشاهده و شمارش نمود.
به طور معمول بهتر است بيشتر از 2 میلی لیتر نمونه كشت ندهيد . مگر اينكه كلني ها ي حاصل از 2 میلی لیتر نمونه كمتر از 30 عدد باشد كه در اين صورت بدون توجه به توصيه بالا تمام كلني ها را بشماريد.به جزء موارد استثنايي نظير اين مورد، در ساير مواقع تنها پليت هاي حاوي 300 30 كلني را به حساب آوريد. پس از شمارش كلني ها در هر پليت ، نتيجه را به صورت تعداد باكتريها در میلی لیتر نمونه بيان نماييد. براي محاسبه مي بايست ميانگين تعداد كلني ها در هر پليت را تعيين كرده و با توجه به ضريب رقيق سازي نمونه در آن پليت، نتيجه را بر حسب CFU /ml گزارش كنيد.
چنانچه در ميان پليت ها ، هيچكدام شمارشي بين 30 تا 300 كلني نداشت و تعدادي از آن ها حاوي بيش از 300 كلني بود از نتيجه تعیین کلونی هائي با نزديكترين عدد به 300 در محاسبات استفاده CFU /ml كنيد. پس از تعين ميانگين شمارش ها در هر پليت نتيجه را با احتساب ضريب رقيق سازي به صورت گزارش نمائيد.
اگر در هيچ يك از پليت ها با ضرايب رقت گوناگون رشد كلني مشاهده نشد نتيجه آزمايش را به صورت کمتر از 1 كلني در نمونه اي با كمترين ضريب رقت ( با احتساب ضريب رقت ) محاسبه كنيد .مثلا چنانچه در پليت حاوي نمونه رقيق شده به نسبت 1 به 100 هيچ كلني شمارش نشد ، نتيجه به صورت كمتر از 100 يعني CFU /ml 100 > گزارش مي شود.
در مواردي كه تعیین کلونی در هر پليت بسيار بيشتر از 300 عدد است . نتيجه را به شكل بسيار بيشتر از حد قابل شمار (TNTC) گزارش نكنيد در اين مواقع چنانچه تع داد كلني ها در واحد سطح كمتر از 2 10 بود ، كلني هاي رشد كرده در 13 مربع ( از صفحات مدرج كلني شمار ) كه توزيع يكنواختي از كلني ها را داشته باشند بشماريد.
بهتر است در صورت امكان 7 مربع متوالي در جهت افقي و 6 مربع متوالي در جهت عمودي را انتخاب كرده و كلني ها را شمارش كنيد. توجه داشته باشيد كه يك مربع را دو بار نشماريد. سپس مجموع كلني هاي شمارش شده در 13 مربع 1 سانتيمتر مربعي را در ع دد 5 cm ) ضرب كنيد تا كل كلني ها در سطح پليت 65 سانتيمتر مربعي 2 5 ) محاسبه شود. اگر تعداد × 13 cm كلني ها در واحد سطح بيشتر از 2 10 بود، فقط 4 مربع انتخابي را شمارش كرده و ميانگين كلني ها / cm ) را در واحد سطح 2براي پليت هاي يكبار × 1 ) محاسبه كنيد.
اين عدد را در ضريب مناسبي ( 57 براي انواع شيشه اي ) ضرب كنيد تا كل كلني ها در سطح پليت به دست آيد . زماني كه × مصرف و 65 cm تعداد كلني ها از 2 100 بيشتر باشد نتيجه را به صورت 6500 < ( براي پليت هاي شيشه اي ) و 5700 / < ( براي پليت هاي پلاستيكي يكبار مصرف ) ضرب در عكس ضريب رقت رقيق ترين نمونه محاسبه و به صورت CFU / ml گزارش كنيد.
اگر حين بررسي پليت ها به كلني هاي اوليه ( گسترش يابنده ) برخورد شد . تنها زماني اين كلني ها شمارش مي شوند كه اولا كلني هاي ثانويه تشكيل شده در سطح عاري از كلني هاي اوليه ، كاملا مشخص و يك نواخت توزيع شده باشند و ثانيا سطح پوشيده شده از كلني هاي گسترش يابنده بيش از نيمي از سطح كل پليت ها را اشغال نكرده با شد.
در صورتي كه كلني هاي گسترش يافته قرار است شمرده شوند ، هريك نوع از انواع زير به عنوان يك واحد كلني در نظر گرفته مي شوند :
- زنجيري از تعیین کلونیكه به نظر مي رسد ، در نتيجه تجزيه يكسري توده باكتري به مخلوط كردن آگار و نمونه به وجود آمده باشد .
- كلني كه به صورت لايه نازكي بين آگار و كف پليت رشد كرده باشد .
- كلني كه در لايه نازك آب موجود در لبه آگار و يا آب روي سطح آگار رشد كرده باشند . دو شكل آخر معمولا در اثر تج مع رطوبت در نقطه اي كه كلني گست رش يابنده در آن تشكيل شده ، به وجود مي آيند . اين گونه كلني ها اغلب بيش از نيمي از سطح پليت را پوشانده و كار شمارش قابل اطمينان و صحيح پليت را با مشكل روبرو مي سازد.
براي تعیین کلونی ها ترجيحاً كلني هاي مستقل و مشابه نزديك به هم ولي نه به هم چسبيده، كه فاصله بين آنها حداقل برابر قطر كوچكترين كلني باشد ، را انتخاب كنيد . هر يك از كلني هاي به هم چسبيده اي كه از نظر شكل ظاهري و يا رنگ متفاوت هستند را مستقل به حساب آوريد.
اگر پليت ها داراي كلني هاي اوليه (گسترش يابنده) بيشتري هستند آنها را به صورت ( spr ) گزارش كنيد . چنانچه پليت ها به دلايلي نظر عدم آگاهي از ميزان رقت، ريختن اتفاقي و آلودگي، غير قابل شمارش بوده و يا محيط كشت هاي كنترل ( شاهد ) علايمي از آلو دگي نشان دادند، نتيجه را تحت عنوان حادثه آزمايشگاهي ( LA ) و يا خطاي آزمايشگاهي گزارش نماييد.
