کشت میکروارگانیسم های آب
اصول کلی این روش ها شامل تلقیح حجم معینی از نمونۀ آب به محیط های کشت جامد یا مایع است. فرض
بر این است که پس از گرمخانه گذاری ، هر میکروارگانیسم تکثیر می یابد و ایجاد کلنی قابل مشاهده روی
محیط کشت جامد و یا تغ ییرات ظاهری در محیط کشت مایع می کند. انتخاب یک روش خاص بستگی به
ماهیت آب، میکروارگانیسم مورد جستجو ، و دلیل آزمون دارد.یکنواختی دما و زمان گرمخانه گذاری :
به طور کلی برای میکروارگانیسم های مورد آزمون، از محدودۀ درجۀ حرارت و زمان به شرح زیر استفاده
کنید :
(5±3 ) °C -20±5 ) و ) °C ، (-70±10 )°C : درجۀ حرارت نگهداری نمونه
(36±2 ) °C 22±2 ) و ) °C : دمای گرمخانه گذاری
(170±10 ) °C 121±3 ) و ) °C : دمای سترون سازی
(68±4 ) h 21±3 ) و )h ، (44±4 )h : زمان گرمخانه گذاری
درجۀ حرارت و زمان ها ی فوق بسیار دقیق است و می تواند اثر زیادی روی رشد میکروارگانیسم ها داشته
باشد. حدود پائینی آن ممکن است برای مدت کوتاهی بیشتر شود ( برای مثال به دلیل باز بودن در گرمخانه )
ولی برگشت دما به حالت اولیه باید سریع صورت گیرد.
محدودۀ مجاز حجم و وزن : محدودۀ قابل قبول به جز در مواردی که تعیین شده باشد % 5± است.
محلول های رقیق کننده و محیط های کشت:
از ترکیبات دارای کیفیت و درجۀ خلوص آزمایشگاهی همسان 1استفاده کنید . از محیط های کشت و
محلول های رقیق کننده را که به صورت آماده در دسترس هستند نیز می توانید استفاده کنید . در این
صورت آماده سازی آن ها را مطابق با دستورالعمل سازنده انجام دهید.
برای پیشگیری از تاثیر مواد روی رشد میکروارگانیسم ها در شرایط آزمون ، از آب تقطیر شده بوسیلۀ
دستگاه های شیشه ای استفاده کنید . ویژگی های آب مقطر مورد استفاده باید با استاندارد ملی ایران
شمارۀ 2747 مطابقت داشته باشد.
برای آماده سازی محیط های کشت، ب ه جز در مواردی که در استاندارد خاص هر میکروارگانیسم
مشخص شده است ، تمام ترکیبات به جای اینکه به حجم معینی رسانده شود باید به حجم معین آب
اضافه شود . پیش از استفاده از محیط های کشت ، کیفیت محیط های کشت ، محلول های رقیق کننده
و صافی ها را کنترل کنید.
سترون سازی
محیط های کشت و محلول های رقیق کننده را در ظروف مناسب برای سترون سازی تقسیم و در
121±3 ) به مدت 15 دقیقه برای سترون سازی )°C اتوکلاو سترون کنید . در بیشتر موارد درجۀ حرارت
کافی است . اگرچه در برخی از موارد ممکن است استفاده از دما و زمان خاص لازم باشد . برای سترون
سازی مواد حساس به حرارت ، در صورت توصیه سازنده می توانید از صافی غشائی با اندازۀ روزنۀ
0/2 استفاده کنید.
محلول های رقیق کننده
5 برای آزمون آب استفاده کنید . پس از -2- 1 تا 6 -2- از یکی از محلول های رقیق کنندۀ بندهای 6
آماده سازی و توزیع محلول های رقیق کننده در ظروف مناسب ،آن را در اتوکلاو با دمای
121±3 ) برای مدت 15 دقیقه سترون کنید . همچنین می توانید محلول های رقیق کننده را پس ) °C
از سترون سازی ، با رعایت شرایط اسپتیک در ظروف پخش کنید.
5±3 )به مدت حداکثر شش ماه می توانید نگهداری کنید. )°C محلول های رقیق کننده را در دمای
در صورت ایجاد هرگونه تغییر ظاهری در محلول های رقیق کننده ، از مصرف آن خودداری کنید.
اصول آزمون
آزمونه و یا رقتی از آن به طور مستقیم یا تغلیظ شده روی صافی غشائی به سطح محیط کشت جامد یا
محیط ذوب شده اضافه می شود تا پس از گرمخانه گذاری روی سطح محیط یا درون آن کلنی تشکیل
شود. فرض براین است که هر کلنی منشاء یک میکروارگانیسم منفرد و یا دس تۀ میکروارگانیسم های
موجود در آزمونه هنگام تلقیح است. با در نظ ر گرفتن حجم آزمونه و تعداد کلنی های تشکیل شده ،
در «2(cfp) 1 یا ذرات تشکیل دهندۀ کلنی (cfu) تعداد واحد های تشک یل دهندۀ کلنی » نتیجه به صورت
100 ) بیان می شود. ml 1 یا ml حجم معینی از نمونه ( برای مثال
روش آزمون
برای تلقیح به محیط کشت جامد ، یکی از روش های زیر را به کار برید:
الف- روش کشت آمیخته 3
در این روش آزمونه با محیط کشت ذوب شده که تا درجۀ حرارت نزدیک به نقطۀ انجماد سرد شده است
،مخلوط می شود .پس از گرمخانه گذاری کلنی های تشکیل شده روی سطح و درون محیط کشت
شمارش می شوند.
ب- روش کشت سطحی 4
در این روش،آزمونه روی س طح محیط کشت آگاردارگسترده می شود و پس از گرمخانه گذاری ،کلنی
های تشکیل شده روی سطح شمارش می شود.
پ- روش صافی غشائی
در این روش آزمونه از صافی غشائی عبور داده می شود و میکروارگانیسم های مورد جستجو روی صافی
باقی می مان ند. سپس صافی روی محی ط کشت آگاردار یا پد جاذب 5 اشباع شده از محیط کشت قرار داده
می شود . پس از گرمخانه گذاری ،کلنی ها روی سطح صافی تشکیل می شوند . همچنین برای
میکروارگانیسم های خاص مانند باکتری های بی هوازی ، صافی را می توان به گونه ای در پلیت قرار داد
که سطح آن به طرف پائین باشد و با لایۀ دیگری از محیط کشت آگار دار پوشانده شود.
انتخاب روش به عوامل مختلفی بستگی دارد . این عوامل شامل ویژگی های فیزیکی و شیمیائی آب ،
ماهیت میکروارگانیسم های مورد جستجو ، غلظت احتمالی آنها ، بازیافت موثر میکروارگانیسم های
آسیب دیده 1 و تحت تنش 2، دقت 3 آزمون و حساسیت لازم می باشد .الزامات هر روش در بند های
5 ارائه شده است (به پیوست اطلاعاتی الف مراجعه شود). -2- 4-2-9 و 9 ، 3-2-9
حجم نمونۀ آب مورد استفاده در هر روش ، محدودیت و درستی 4 روش دربند الف- 2 پیوست الف شرح
داده شده است . همچنین الزام ات هر روش ممکن است انتخاب روش را تحت تاثیر قرار دهد برای مثال
دقت مطلوب و اهمیت وجود یا عدم وجود یک میکروارگانیسم در حجم معین نمونۀ آب.
روش کشت آمیخته
آزمونه
0/1 ml حجم آزمونه و یا رقتی از نمونه بسته به اندازۀ پلیت و حجم محیط کشت مورد استفاده بین
5 است . رقت باید به گونه ای انتخاب شود که تعداد مورد انتظار کلنی های تیپیک 5 تشکیل شده ml تا
100 بین 10 تا 150 کلنی باشد. تعداد کل کلنی ها ی تیپیک mm 90 تا mm روی پلیت هائی با قطر
و غیر تیپیک 6 روی پلیت باید کمتر از 300 کلنی باشد ( به استاندارد ملی ای ران شمارۀ 2325 مراجعه
شود).
یادآوری- تعداد کل کلنی های قابل شمارش به اندازۀ کلنی بستگی دارد و برای کلنی های بزرگتر تعداد ممکن است
کاهش یابد.
تلقیح
محیط ک شت مورد استفاده را در حمام آب جوش ذوب کنید . از سایر فرایند های مناسب مانند قرار دادن
در جریان بخار آزاد اتوکلاو یا ماکروویو و سایر فرایند های مناسب که ترکیب دما و زمان آن برای آماده
سازی محیط کشت ، صحه گذاری شده است نیز می توانید استفاده کنید . از حرارت دادن زیاد محیط
کشت خودداری کنید و آن را به محض ذوب شدن از حمام آب خارج کنید . محیط کشت ذوب شده را
45° برسد. پس از تهیه و آماده سازی پلیت C 45±1 ) قرار دهید تا دمای آن به ) °C در حمام آب با دمای
2 این استاندارد ، آزمونه را کاملاَ مخلوط و در پلیت ها تقسیم – ها و رقت های لازم ، .مطابق با بند 8
هر یک از لوله ها و ارلن ها را به نوبت از حمام آب خارج کنید و پس از خشک کردن قسمت بیرونی آن
، گردن ظرف را از روی شعله عبور دهید . محیط کشت را بدون تأ خیر به پلیت ها به گونه ای بیافزائید
که ایجاد شوک حرارتی برای آزمونه به حداقل برسد . سپس به منظور توزیع یکنواخت میکروارگانیسم ها ،
آزمونه و محیط کشت را کام لاً مخلوط کنید . به طور کلی برای یک میلی لیتر تا دو میلی لیتر
15 محیط کشت استفاده می شود. برای حجم های بیشتر آزمونه ،مقدار محیط کشت را ml آزمونه،مقدار
بر همین اساس تنظیم کنید.
پلیت ها را روی سطح افقی قرار دهید تا سرد شود و محیط آگاردار جامد شود . پس از جامد شدن آگار ،
6 گرمخانه گذاری کنید. -2- پلیت ها را بدون تأخیر طبق بند 9
یادآوری – کاربرد سیستم های آماده کننده آگار 1 برای آ زمایشگاه ها ئی که دارای تعداد زیاد نمونه هستند ، مفید می
باشد.
روش کشت سطحی
آزمونه
0/1 ت ا ml 100 ، حجم آزمونه و یا رقتی از آ ن باید بین mm 90 ت ا mm برای پلیت هائی با قطر
0/5 باشد. رقت ر ا به گونه ای انتخاب کنید که در آن تعداد مورد انتظار کلنی ها ی تشکیل شده بین ml
10 تا 150 کلنی تیپیک باشد. تعداد کل کلنی های تیپیک و غیرتیپیک روی پلیت باید کمتر از 200
کلنی باشد.
یادآوری- تعداد کل کلنی های قابل شمارش ، به اندازۀ کلنی ها بستگی دارد و برای کلنی های بزرگتر تعداد کلنی ها
ممکن است کاهش یابد.
تلقیح
15 محیط کشت را آماده و نشانه گذاری کنید . در صورت لزوم سطح محیط ml پلیت های دارای حدود
های کشت را پیش از استفا ده خشک کنید . آزمونه را بوسیلۀ پیپت روی سطح پلیت بریزید و سپس با
استفاده از میلۀ شیشه ای سترون و یا وسایل مکانیکی آن را روی سطح پخش کنید . پس از جذب مادۀ
6 گرمخانه گذاری کنید. -2- تلقیحی ،پلیت ها را مطابق با بند 9
برای خشک کردن پلیت ها ، توجه به نکات زیر مهم است :
الف- میزان رطوبت در محیط کشت مهم است زیرا رشد بهینۀ باکتری ها به شرایط رطوبت درون و
سطح محیط کشت بستگی دارد .از دست دادن رطوبت زیاد ممکن اس ت منجر به افزایش غلظت مواد
بازدارندۀ در محیط های کشت انتخابی و کاهش فعالیت آب 1 در سطح محیط کشت شود.
ب- در مورد باکتری هائی که کلنی آن ها به سرعت روی محیط کشت پخش نمی شوند و سطح
محیط کشت در پلیت ها خشک به نظر می رس د، ، خشک کردن سطح پلیت ها ضرورت ندارد . در این
موارد ، می توانید خشک کردن سطح پلیت ها را حذف کنید ، زیرا باع ث افزایش احتمال آلودگی و از
دست دادن بی مورد رطوبت می شود.
پ- درجۀ حرارت و زمان خشک شدن را به گونه ای انتخاب کنید که احتمال آلودگی تا حد ممکن
پائین نگه داشته شود و درجۀ حرارت اثر سوئی روی کیف یت محیط کشت نداشته باشد .زمان خشک
شدن به میزان بخار آبی که در سطح محیط کشت در پلیت ها قرار گرفته است بستگی دارد ولی باید تا
حد امکان کوتاه نگه داشته شود.
ت- چنانچه برای خشک کردن پلیت ها از اتاقک با جریان هوای لایه ای 2 استفاده نمی کنید ، برای
پیشگیری از آلودگی پلیت ها ، سطح محیط کشت را به طرف پائین قرار دهید.
50° به گونه ای که سطح آگار پلیت ها به طرف C 25 تا °C در عمل پلیت ها با قرار دادن در گرمخانۀ
پائین باشد و در پلیت نیمه باز باشد ، خشک می شوند.
خشک کردن پلیت ها را تا زمان ناپدید شدن قطرات در سطح آگار یا روی در پلیت ادامه دهید . بیش از
آن، خشک کردن را ادامه ندهید . همچنین می توانید پلیت ها را در اتاقک ایمنی با جریان هوای لایه ای
در دمای محیط برای مدت 30 دقیقه تا 60 دقیقه یا به مدت یک شب 3 به صورت دربسته در درجۀ
حرارت محیط خشک کنید.
روش صافی غشائی
آزمونه
حداکثر حجم آزمونه به قابلیت صاف شدن نمونۀ آب و صافی غشائی مورد استفاده بستگی دارد . این
روش برای آب هائی مانند آب آشامیدنی که دارای مقادیر کمی از ذرات یا مو اد کلوئیدی ( مانند آهن )
0/45 امکان صاف کردن چندین μm به صورت معلق هستند ، کاربرد دارد . با صافی هائی با اندازۀ روزنۀ
لیتر از چنین آب هائی با استفاده از یک صافی و در نتیجه دستیابی به حساسیت بالای آزمون وجود دارد
برای دانلود متن کامل استاندارد 4207 بر روی لینک زیر کلیک کنید
